Page 125 - 《广西植物》2025年第11期

１１ 期 胡晓玉等: 转录组分析马缨杜鹃响应高温胁迫的分子机制 ２ ０ ６ ９

水平的升高ꎬ这表明多种植物激素可能在海南杜 ｒｅａｄｓ 与参 考 序 列 的 Ｈｉｓａｔ２ 比 对 结 果ꎬ 使 用 软 件
鹃增强对热胁迫耐受性的热应激反应中扮演重要 Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ 进行转录本的拼接和表达定量ꎮ
角色(Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８)ꎮ 通过转录组分析鉴定植 １.４ 转录组数据处理
物在响应高温时发挥关键作用的代谢途径ꎬ有助 采 用 ＤＥＳｅｑ２ 筛 选 两 组 间 差 异 表 达 基 因
于我们进一步剖析热响应机制ꎮ 因此ꎬ对高温胁 (ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓꎬＤＧＥｓ) ( Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ.ꎬ
迫后马缨杜鹃进行转录组分析ꎬ有助于探明马缨 ２０１４)ꎬ设定阈值为 ｜ ｌｏｇ Ｆｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ ｜ ≥１ 且 ＦＤＲ<
２
杜鹃热胁迫应答的分子机制ꎬ为今后的研究提供 ０.０５ ( Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ ＆ Ｈｏｃｈｂｅｒｇꎬ １９９５ )ꎮ 采 用
丰富的基因信息ꎮ ＧＯＡＴＯＯＬＳ 软 件 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｇｉｔｈｕｂ. ｃｏｍ / ｔａｎｇｈａｉｂａｏ /
本研 究 以 马 缨 杜 鹃 幼 苗 为 研 究 材 料ꎬ 依 托 ＧＯａｔｏｏｌｓ) 与 Ｐｙｔｈｏｎ ｓｃｉｐｙ 软 件 包 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｓｃｉｐｙ.
ＲＮＡ￣ｓｅｑ 转录组测序技术ꎬ采用高温胁迫处理结合 ｏｒｇ / ｉｎｓｔａｌｌ/ )分别进行 ＧＯ 富集分析和 ＫＥＧＧ 通路

生物信息学分析方法ꎬ通过差异表达基因筛选、ＧＯ 富集分析ꎬ检验方法为 Ｆｉｓｈｅｒ 精确检验ꎬ并通过采
和 ＫＥＧＧ 富集分析以及转录因子鉴定ꎬ拟探讨以 用 ＢＨ(ＦＤＲ) 对 Ｐ 值进行了校正( Ｋｌｏｐｆｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ
下问题:(１)分析耐热性相关的代谢通路及其调控 ａｌ.ꎬ ２０１８)ꎬ当 Ｐ 值( Ｐ￣ＦＤＲ) < ０.０５ 时ꎬ筛选在热
机制ꎻ(２)植物激素信号转导通路响应高温胁迫的 胁迫下显著富集的通路ꎮ 对测序后差异表达转录
机制ꎻ(３)转录因子对耐热响应的特异性调控ꎮ 因子互作对进行整理ꎬ使用 Ｒ 语言计算相关性系
数ꎬ利用 Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ 软件绘制热相应转录因子互作
１ 材料与方法 网络 ( Ｏｅｓｐｅｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１１ )ꎬ 参 数 为 Ｐ < ０. ０５ꎬ
Ｐｅａｒｓｏｎ 绝对值大于 ０.８５ꎮ
１.１ 马缨杜鹃高温胁迫实验 １.５ ＲＴ￣ｑＰＣＲ 验证
以 ２ 年生马缨杜鹃幼苗为材料ꎬ将供试材料放 为验证转录组数据的可靠性ꎬ选取 ６ 个 ＤＥＧｓ
入恒温光 照 培 养 箱ꎬ在 ２５ ℃ / ２０ ℃ ( １４ ｈ / １０ ｈꎬ 通过 ＲＴ￣ｑＰＣＲ 技术进行表达量验证ꎮ 采用 ＮＣＢＩ
昼 / 夜)条件下预处理 ７ ｄꎬ第 ８ 天进行 ３８ ℃ (１４ ｈ / 网站引物设计(表 １)ꎬ并以马缨杜鹃 １８ｓＲＮＡ 基因
１０ ｈꎬ昼 / 夜)高温持续处理 ３ ｄ( Ｈ３) 和 ６ ｄ( Ｈ６)ꎬ 作为内参ꎮ 实验样品设 ３ 个生物学重复ꎬ相对表
用非 胁 迫 处 理 的 同 一 阶 段 的 幼 苗 作 为 对 照 组 达量分析使用 ２ －ΔΔＣｔ ꎮ
(ＣＫ)ꎬ每个处理 ９ 株ꎬ设 ３ 个生物学重复ꎮ 试验组
与对照组除温度不同以外ꎬ其他条件均一致ꎮ 人 ２ 结果与分析
工气候箱光照强度为 ６ ０００ ｌｘꎬ相对湿度为 ８０％ꎬ
高温处理期间定时补水保湿ꎮ 处理后ꎬ收取每株 ２.１ 转录组测序及组装
第一、第二叶ꎬ每 ３ 盆的叶片混合作为 １ 个处理样 对 ９ 个不同时期高温胁迫马缨杜鹃叶片样品进
本ꎬ快速取样后用锡纸包好并迅速放入液氮中ꎬ０.５ 行转录组测序ꎬ共获得 ９０.５４ Ｇｂ 干净数据( Ｃｌｅａｎ
ｈ 后转入－８０ ℃ 冰箱保存ꎬ用于转录组测序分析ꎮ Ｄａｔａ)ꎮ 各样品 Ｃｌｅａｎ Ｄａｔａ 均在 ８.９２ Ｇｂ 以上ꎬ各样
１.２ 马缨杜鹃叶片 ＲＮＡ 的提取、质量检测 品的 Ｑ２０ 值在 ９８. １８％ 和 ９８. ５０％ 之间ꎬ各样品的
采用华越洋植物总 ＲＮＡ 提取试剂盒( 货号为 Ｑ３０ 值在 ９４.４２％和 ９５.２６％之间ꎬＧＣ 含量在 ４４.１１％
０４１６￣５０)提取马缨杜鹃叶片总 ＲＮＡꎬ采用 １％琼脂 和 ４４.８９％之间ꎬ说明测序质量较高ꎬ转录组数据可
糖凝胶电泳检测 ＲＮＡ 完整性ꎬ采用微量紫外分光 用于后续分析ꎮ 以公布的马缨杜鹃基因组作为参

光度计定量检测 ＲＮＡ 样品的质量ꎮ 考基因组ꎬ马缨杜鹃转录组序列匹配到参考基因组
１.３ 马缨杜鹃叶片转录组测序和组装 数据库的匹配率从 ９２.４１％到 ９４.３４％不等ꎬ表明转
合格样品交由北京百迈客生物科技有限公司 录组数据质量较好ꎬ可用于后续基因分析(表 ２)ꎮ
进行转录组测序ꎬ以公布的马缨杜鹃基因组为参 ２.２ 差异表达基因(ＤＥＧｓ)统计分析

考 基 因 组 ( ｈｔｔｐ: / / ｂｉｏｉｎｆｏｒ. ｋｉｂ. ａｃ. ｃｎ / ＲＰＧＤ / 马缨杜鹃高温胁迫后样本的 ＰＣＡ 分析( 图 １:
ｄｏｗｎｌｏａｄ＿ｇｅｎｏｍｅ. ｈｔｍｌ)ꎬ注释版本为 ｖｅｒｓｉｏｎ ２ꎬ过 Ａ)可见ꎬ组内一致性好ꎬ组间差异大ꎬ表明实验设
滤原始数据中低质量的序列之后使用软件 Ｈｉｓａｔ２ 计科学且合理ꎮ 对马缨杜鹃两组间差异表达基因
将测序 ｒｅａｄｓ 比对到参考基因组上ꎬ基于各样品 进行韦恩分析发现ꎬＨ３ ｖｓ ＣＫ 特异表达的基因有