Page 17 - 《广西植物》2025年第4期

４ 期 李海清等: 滇牡丹花瓣色斑形成的分子机制研究 ６ ３ １

参基因ꎬ 采 用 ＴＲＡＮＳ ＢＩＯＴＥＣＨ 试 剂 盒 ( 货 号 为
ＡＱ６０１)并按照说明书进行实验ꎬ在 ７５００Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ
ＰＣＲ 仪器中进行 ３ 次生物学重复 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 检测ꎬ
－△△Ｃｔ
再通过 ２ 分析来估算其表达水平ꎮ

表 １ 特异性引物和内参引物
Ｔａｂｌｅ １ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｐｒｉｍｅｒｓ
引物名称
引物序列 (５′￣３′) 用途
Ｐｒｉｍｅｒ
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′￣３′) Ｕｓａｇｅ
ｎａｍｅ
ＰｄＭＹＢ３０ Ｆ: ＧＡＡＧＣＣＴＣＴＣＡＧＧＣＣＧＴＡＴＣ ｑＲＴ￣ＰＣＲ
Ｒ: ＡＧＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＧＡＡＧＡＧＣＣ
ＰｄＣＨＩ Ｆ: ＣＡＧＡＣＧＣＣＡＧＡＧＧＧＡＴＣＡＴＴ ｑＲＴ￣ＰＣＲ
ＮＢ￣Ｓ１. 无色斑黄花硬蕾期ꎻ ＮＢ￣Ｓ２. 无色斑黄花盛开期ꎻ
Ｒ: ＴＴＧＣＴＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＣＡＣＣＡ
Ｂ￣Ｓ１. 红色斑黄花硬蕾期ꎻ Ｂ￣Ｓ２. 红色斑黄花盛开期ꎮ
ＰｄＣＨＳ Ｆ: ＧＴＧＴＧＣＴＴＡＧＣＧＡＧＴＡＣＧＧＴ ｑＲＴ￣ＰＣＲ
ＮＢ￣Ｓ１. Ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｏｗｅｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｏｌｏｕｒ ｓｐｏｔ ｂｕｄ ｓｔａｇｅꎻ ＮＢ￣Ｓ２.
Ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｏｗｅｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｏｌｏｕｒ ｓｐｏｔ ｂｌｏｏｍｉｎｇ ｓｔａｇｅꎻ Ｂ￣Ｓ１. Ｙｅｌｌｏｗ Ｒ: ＴＧＧＡＧＣＡＣＣＡＣＡＧＴＣＴＣＡＡＣ
ｆｌｏｗｅｒ ｗｉｔｈ ｒｅｄ ｓｐｏｔ ｂｕｄ ｓｔａｇｅꎻ Ｂ￣Ｓ２. Ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｏｗｅｒ ｗｉｔｈ ｒｅｄ ｓｐｏｔ ＰｄＤＦＲ Ｆ: ＧＣＣＡＴＣＣＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＧＴＣ ｑＲＴ￣ＰＣＲ
ｂｌｏｏｍｉｎｇ ｓｔａｇｅ.
Ｒ: ＴＡＧＣＧＡＣＣＣＴＣＴＧＣＴＴＴＴＧＧ
图 １ 滇牡丹花色表型 Ａｃｔｉｎ Ｆ: ＧＧＡＣＡＡＧＴＣＡＴＴＡＣＣＡＴＣＧＧＡ ｑＲＴ￣ＰＣＲ
Ｆｉｇ. １ Ｆｌｏｗｅｒ ｃｏｌｏｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ Ｐａｅｏｎｉａ ｄｅｌａｖａｙｉ Ｒ: ＣＴＧＡＴＡＴＣＣＡＣＡＴＣＡＣＡＣＴＴＣＡＴＧ

(ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ. ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ. ｏｒｇ / ｉｎｄｅｘ. ｊｓｐ) 下载拟 南
芥 ＭＹＢ 转录因子氨基酸序列ꎬ同 ＰｄＭＹＢ３０ 进行 ２ 结果与分析
系统发育分析来预测其功能ꎮ 借助转录因子差异
基因表达热图ꎬ将与色斑形成相关的结构基因和 ２.１ 转录组测序质量分析
通过对 ２ 种表型植株花瓣 ２ 个发育时期转录
转录因子进行聚类分析ꎮ
基 于 ＮＣＢＩ 的 ＢＬＡＳＴ 结 果ꎬ 选 择 了 与 组数据分析显示ꎬ无色斑黄色花硬蕾期花瓣( ＮＢ￣
ＰｄＭＹＢ３０ 氨基酸同源性较高的物种序列进行多重 Ｓ１)、无色斑黄色花盛开期花瓣( ＮＢ￣Ｓ２)、红色斑
序列对比分析ꎬ并使用 ＤＮＡＭＡＮ ６.０.３.９９ 软件对 黄色花硬蕾期花瓣(Ｂ￣Ｓ１) 和红色斑黄色花盛开期
ＰｄＭＹＢ３０(Ｍｉｘ￣７４＿ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ＿１４２８６２) 和其他植物 花瓣(Ｂ￣Ｓ２) 的基因读数、基数、ＧＣ 含量等为 ３ 个
的一 些 与 花 青 素 生 物 合 成 及 色 斑 形 成 相 关 的 生物学 重 复 测 序 的 最 小 值 到 最 大 值 的 范 围 ( 表
２)ꎬ共获得 １５ Ｇｂ 的高质量数据ꎬ经过去除冗余后
Ｒ２Ｒ３￣ＭＹＢ 蛋白进行了多序列比对ꎮ 通过 ＭＥＧＡ
１１.０ 软件构建系统发育树ꎬ并采用 ｂｏｏｔｓｔｒａｐ 方法 剩余２３０ ４４７ ９８７干净读数( ｃｌｅａｎ ｒｅａｄｓ)ꎬＧＣ 含量
范围为 ４４.３２％ ~ ４５.３２％ꎮ 此外ꎬＱ２０ 碱基均不低
进行了检验ꎬ测试次数为 １ ０００ 次ꎮ
１.７ 影响色斑形成相关基因实时 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 分析 于 ９８.０８％ꎬＱ３０ 碱基不低于 ９４.３２％ꎬ表明测序质
为了验证滇牡丹测序数据的每百万个映射读 量良好ꎬ干净数据(ｃｌｅａｎ ｄａｔａ)质量符合要求ꎬ数据

取的 转 录 本 每 千 碱 量 片 段 数 ( ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏ 可信度高ꎮ
ｂａｓｅｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｒｅａｄ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｓꎬ ＦＰＫＭ)的 通过 Ｔｒｉｎｉｔｙ 软件分析ꎬ共获得 ６３ ９８１ 个单基
准确性ꎬ选取类黄酮生物合成通路中差异表达的 因ꎬ包含 ３５ １６４ ３２３ 个碱基ꎬＮ５０ 长度为 ９９１ ｂｐꎬ
关键结构基因和转录因子在 ２ 种表型的滇牡丹植 其中最短的为 １７５ ｂｐꎬ最长的为 ４ ３７８ ｂｐꎬ平均长

株花瓣的 ２ 个时期进行实时荧光定量 ＰＣＲ( ｑＲＴ￣ 度为 ８０５ ｂｐꎮ
ＰＣＲ)分析ꎮ ｃＤＮＡ 合成采用 ＡＱ６０１( 北京全式金 ２.２ 代谢物分析
生物技术股份有限公司) 试剂盒ꎮ 采用 ＴＢｔｏｏｌｓ 进 为了探究滇牡丹种间色斑形成的原因ꎬ用同
行特异性引物设计(表 １)ꎮ 滇牡丹所选 Ａｃｔｉｎ 为内 时采集的 ２ 种表型植株 ３ 个生物学重复的实验材