Page 16 - 《广西植物》2025年第4期

６ ３ ０ 广 西 植 物 ４５ 卷
研究为滇牡丹色斑形成的机理研究提供了重要 ＲＩＮ)设置在 ６.５ 以上ꎮ 对样品进行检测并确保其
参考ꎮ Ｌｕａｎ 等(２０２２) 认为牡丹中 ＰｓＭＹＢ３０ 是斑 质量合格后ꎬ由北京诺禾致源生物信息技术有限
点形成的转录因子ꎬ调控和激活了参与花青素生 公司创建 ｃＤＮＡ 文库并进行 Ｉｌｌｕｍｉｎａ 测序ꎮ
物合成的下游 ＰｓＡＮＳ 基因ꎮ 综上所述ꎬ转录因子 １.３ 代谢物分析
对色斑的调控具有重要的参考意义ꎬ在不同类型 将采集的滇牡丹花瓣装入冻存管后迅速放入
的转录因子中ꎬＭＹＢ 对于控制类黄酮生物合成通 液氮罐冷冻保存ꎬ使用球磨仪( 德国 Ｒｅｔｓｃｈ 公司)

路至关 重 要ꎬ 与 类 黄 酮 生 物 合 成 相 关 的 Ｒ２Ｒ３￣ ３０ Ｈｚ、１.５ ｍｉｎ 研磨至粉末状ꎬ每例样品称取 ５０
ＭＹＢ 转录因子被认为在亚组中具有保守功能ꎬ对 ｍｇꎬ加入 ５００ μＬ 的 ８０％甲醇ꎬ涡旋混匀ꎬ冰浴中超
￣１
花青素 生 成 具 有 转 录 激 活 作 用 ( Ｔｏｈｇｅ ｅｔ ａｌ.ꎬ 声 ２０ ｍｉｎꎬ１６ ０００ ｒｍｉｎ 离心 １５ ｍｉｎꎬ取上清液进
２００５) ꎮ 行 ＬＣ￣ＭＳ 分析ꎮ 对样品数据使用超高效液相色谱
滇牡丹不仅花瓣颜色表型丰富ꎬ而且还在花瓣 系 统 ( ＵＰＬＣ) 及 色 谱 柱 ( ＡＣＱＵＩＴＹ ＢＥＨ Ｃ １. ７
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基部形成形状、大小和颜色深浅不一的色斑ꎬ然而 μｍꎬ２.１ ｍｍ × １００ ｍｍ)进行分离ꎮ 其中ꎬ进样量 ２
￣１
对其色斑形成的分子机理的研究鲜有报道ꎮ 因此ꎬ μＬꎬ柱温 ４０ ℃ ꎬ流速 ３５０ μＬｍｉｎ ꎻ色谱流动相 Ａ
本研究以滇牡丹复合群 ( 洪德元ꎬ２０１６) ( Ｐａｅｏｎｉａ 为超纯水( 加入 ０.１％ 的甲酸)ꎬ流动相 Ｂ 为甲醇
ｄｅｌａｖａｙｉ ｃｏｍｐｌｅｘ)的 ２ 种表型的植株ꎬ即无色斑黄色 (加入 ０.１％的甲酸)ꎮ
花瓣植株和黄色花瓣基部带红色斑块植株(图 １)为 １.４ 转录组基因表达分析及基本注释
研究材料ꎬ采用 ＲＮＡ￣ｓｅｑ 技术对 ２ 种表型植株花瓣 通过 Ｑ２０、Ｑ３０ 指标以及 ＧＣ 值ꎬ用以评估转录
的硬蕾期和盛花期进行转录组测序和代谢组测序ꎬ 组清洁数据的质量ꎮ 使用 Ｔｒｉｎｉｔｙ(ｖ２.６.６)完成转录
拟解决以下科学问题:(１) 影响滇牡丹色斑形成的 组组装ꎬ基于以下数据库进行基因功能注释ꎮ 使用
关键基因ꎻ(２) 滇牡丹 ２ 种表型植株花瓣的花青素 ＢＬＡＳＴ 软件(ｖｅｒｓｉｏｎ ２.２.２６)将它们与基于 ＮＲ 数据
含量差异ꎻ(３)滇牡丹转录因子 ＰｄＭＹＢ３０ 对色斑形 库(ＮＣＢＩ 非冗余)、Ｓｗｉｓｓ￣Ｐｒｏｔ 蛋白数据库、ＫＥＧＧ 数
成的调控激活作用ꎮ 研究结果不仅能为牡丹新品 据库以及 ＣＯＧ 和 ＧＯ 数据库进行注释ꎮ 转录本丰
种培育工作和调控色斑基因的研究提供理论依据ꎬ 度(读取计数)由 ＲＳＥＭ 估计ꎬ使用 Ｔｒｉｎｉｔｙ 剪接作为
还能为木本观赏植物色斑形成机理的研究补充丰 参考序列ꎬ并将清洁样本读数映射到参考序列ꎬ采
富的案例进而发挥重要的参考价值ꎮ 用 ＦＰＫＭ 方法衡量基因的表达水平ꎮ
１.５ 差异基因和基因功能分析
１ 材料与方法 采用 Ｉｌｌｕｍｉｎａ 技术对滇牡丹 ２ 种表型植株花

瓣进行测序分析ꎬ并对 Ｕｎｉｇｅｎｅｓ 进行组装ꎬ用于
１.１ 实验材料 样本组之间差异表达的后续分析ꎮ 通过错误发
实验材料均采自海拔 ２ ４００ ｍ 的梁王山滇牡 现率( ｆａｕｌｔ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅꎬＦＤＲ) ≤０.０１ 和倍数变
丹资源收集圃(１０２°４２′０５″ Ｅ、２４°４５′２３″ Ｎ)ꎮ 选 化≥２ 且 Ｐ ｖａｌｕｅ ≤ ０. ０５ 为 筛 选 差 异 表 达 基 因
择无色斑黄色花瓣和黄色花瓣基部带红色斑块的 ( ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓꎬ ＤＥＧｓ) 标 准ꎬ来 找
２ 种表型的滇牡丹植株ꎬ分别采集硬蕾期( 被花萼 出类黄酮生物合成通路中的 ＤＥＧｓꎮ 通过 ＫＯＢＡＳ
完全紧实包裹的花蕾) 和盛花期( 花瓣展开ꎬ雌雄 ( ＫＥＧＧ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｙ￣Ｂａｓｅｄ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ) 软 件
蕊可见)２ 个发育阶段的花瓣( 图 １)ꎬ保存在液氮 测试 ＫＥＧＧ 通路中 ＤＥＧｓ 的统计富集度ꎮ 根据转

中带回实验室储存在－ ８０ ℃ 冰箱作为实验材料ꎮ 录组数据检索转录因子数量和类型ꎬ对比到其他
每种表型选择 ３ 个植株ꎬ作为 ３ 个生物学重复ꎬ采 植物花瓣色斑形成的研究中ꎬ进一步挖掘影响滇

集 ２ 个发育阶段的花瓣ꎮ 牡丹色斑形成的关键基因ꎮ
１.２ 转录组测序 １.６ 滇牡丹 ＰｄＭＹＢ３０ 转录因子的鉴定和分析

通过 采 用 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 技 术ꎬ 使 用 ＲＮＡ 通过对滇牡丹 ２ 种表型植株花瓣转录组数据
Ｎａｎｏ ６０００ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ 定量总 ＲＮＡ 样本的质量、浓 库中的转录因子序列进行深度检索ꎬ获得了滇牡
度及其完备程度ꎬ使用超过 １.５ μｇ 的总 ＲＮＡꎬ每个 丹 ＰｄＭＹＢ３０(Ｍｉｘ￣７４＿ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ＿１４２８６２) 的详细序
样 品 的 ＲＮＡ 完 整 性 数 ( ＲＮＡ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｎｕｍｂｅｒꎬ 列注 释 信 息ꎮ 此 外ꎬ从 拟 南 芥 数 据 库 网 站 ＴＡＩＲ