Page 71 - 《广西植物》2025年第7期

７ 期 陈宇姝等: 低温胁迫下外源油菜素内酯对冬小麦 ＲＥＶＥＩＬＬＥ ７￣ｌｉｋｅ 基因表达的影响 １ ２ ６ ３

家基因验证模板是否提取成功ꎬ成功后将模板置 软件( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ. ｅｂｉ. ａｃ. ｕｋ / Ｔｏｏｌｓ/ ｍｓａ / ｃｌｕｓｔａｌｏ / )
于－２０ ℃ 冰箱储存ꎮ 进行 氨 基 酸 多 序 列 比 对ꎻ 用 ｐｌａｎｔｃａｒｅ ( ｈｔｔｐ: / /
１.２.２ ＲＥＶＥＩＬＬＥ ７￣ｌｉｋｅ 基因的克隆 从‘东农冬麦 ｗｅｂ.ｗｅｂｔｏｏｌｓ/ ｐｌａｎｔｃａｒｅ / ｈｔｍｌ/ ) 进 行 蛋 白 的 启 动 子
１ 号’转录组数据中得到 ＲＥＶＥＩＬＬＥ ７￣ｌｉｋｅ 基因的 预测ꎻ用 Ｐｒｏｔｓｃａｌｅ 软件( ｈｔｔｐ: / / ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ / ｃｇｉ￣
序列全长ꎬ在 ＮＣＢＩ 上进行比对ꎬ比对结果一致ꎬ用 ｂｉｎ / ｐｒｏｔｓｃａｌｅ / )分析 ＲＥＶＥＩＬＬＥ ７￣ｌｉｋｅ 蛋白的亲、疏
软件 Ｐｒｉｍｅｒ ５.０ 设计该基因全长序列的特异性引 水性ꎻ用软件 ＳＯＰＭＡ 和 Ｓｗｉｓｓ Ｍｏｄｅｌ 对该蛋白的二

物 ＲＥＶＥＩＬＬＥ ７￣ｌｉｋｅ １Ｆ / １Ｒ(表 １)ꎬ构建 ２０ μＬ ＰＣＲ 级、三级结构进行预测和建模ꎮ 利用软件 ＭＥＧＡ
反应体系ꎬ反应程序如下:９４ ℃ 预变性 ５ ｍｉｎꎬ９４ ７.０ 中 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣Ｊｏｉｎｉｎｇ( ＮＪ) 法构建 ＲＥＶＥＩＬＬＥ ７￣
℃ 变性 ３０ ｓ、５５ ℃ 退火 ３０ ｓ、７２ ℃ 延伸 ９０ ｓꎬ共进 ｌｉｋｅ 蛋白与多物种的系统发育树ꎬ并通过 ＭＥＭＥ￣
行 ３０ 个循环ꎬ７２ ℃ 终延伸 １０ ｍｉｎꎮ 先将胶回收且 Ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ 软 件 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｍｅｍｅ￣ｓｕｉｔｅ. ｏｒｇ / / ｍｅｍｅ / )
与 ｐＭＤ１８￣Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ 载体相连[宝日医生物技术( 北 分析蛋白的保守结构域和保守基序(ｍｏｔｉｆ)ꎮ
京)有限公司]ꎬ再将连接产物转入到大肠杆菌感 １.２.４ ＲＥＶＥＩＬＬＥ ７￣ｌｉｋｅ 基因的表达量分析 由生工
受态细胞ꎬ培养 １４ ｈ 挑单菌落摇 １４ ｈ 后进行菌液 生物工程( 上海) 股份有限公司合成 ＲＥＶＥＩＬＬＥ ７￣
ＰＣＲꎬ条带位置正确ꎬ提质粒ꎬ送宝日医生物技术 ｌｉｋｅ 基因的 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 引物ꎬ以及内参基因 Ａｃｔｉｎ 引
ＴＭ
(北京)公司测序ꎮ 物(表 １)ꎬ根据 ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ 说明书设
１.２.３ ＲＥＶＥＩＬＬＥ ７￣ｌｉｋｅ 蛋白的生物信息学分析 计 ２０ μＬ 反应体系ꎬ反应程序如下:９５ ℃ 预变性
用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ 在 线 网 站 ( ｈｔｔｐ: / / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / ３０ ｓꎬ９５ ℃ 变性 ５ ｓ、６０ ℃ 退火延伸 ３４ ｓꎬ共 ４０ 个
ｃｇｉ￣ｂｉｎ / ｐｒｏｔｐａｒａｍ / ) 分析 ＲＥＶＥＩＬＬＥ ７￣ｌｉｋｅ 蛋白的 循环ꎮ 设 置 ３ 次 生 物 学 重 复ꎬ 采 用 ２ －△△Ｃｔ 法 和
分子量、等电点等理化性质ꎻ用 Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ 在线 ＳＰＳＳ 软件对实验数据进行分析和处理ꎮ

表 １ 实验所用引物
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
引物 序列 (５′－３′) 用途
Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′－３′) Ｐｕｒｐｏｓｅ
ＲＥＶＥＩＬＬＥ ７￣ｌｉｋｅ￣１Ｆ ＡＴＧＧＣＴＣＧＴＴＴＴＣＡＧＧＡＡＡＣＣＡＡ 克隆基因全长
ＲＥＶＥＩＬＬＥ ７￣ｌｉｋｅ￣１Ｒ ＴＴＡＣＡＡＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＧＴＣＡＴＣＴＣＴ Ｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈ ｃｌｏｎｉｎｇ
ＲＥＶＥＩＬＬＥ ７￣ｌｉｋｅ￣２Ｆ ＡＧＧＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＡＣＡＧ 实时荧光定量 ＰＣＲ
ＲＥＶＥＩＬＬＥ ７￣ｌｉｋｅ￣２Ｒ ＧＧＧＣＴＣＡＣＡＣＧＣＴＣＴＣＴＣＡＡＡＣ ｑＲＴ￣ＰＣＲ

ＴａＡｃｔｉｎ￣Ｆ ＣＣＴＴＡＧＴＡＣＣＴＴＣＣＡＡＣＡＧＡＴＧＴ 实时荧光定量 ＰＣＲ 内参基因
ＴａＡｃｔｉｎ￣Ｒ ＣＣＡＧＡＣＡＡＣＴＣＧＣＡＡＣＴＴＡＧＡ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ ｏｆ ｑＲＴ￣ＰＣＲ

２.２ ＲＥＶＥＩＬＬＥ ７￣ｌｉｋｅ 基因编码蛋白质的生物信息
２ 结果与分析 学分析

２.２.１ ＲＥＶＥＩＬＬＥ ７￣ｌｉｋｅ 蛋白的系统进化分析和 ｍｏｔｉｆ
２.１ ＲＥＶＥＩＬＬＥ ７￣ｌｉｋｅ 基因的克隆及序列分析 预测 图 ２ 为 小 麦 ( Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ) 与 节 节 麦
用反转录获得的 ｃＤＮＡ 作为模板ꎬ将表 １ 中 (Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｔａｕｓｃｈｉｉ)、二粒小麦(Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｄｉｃｏｃｃｏｉｄｅｓ)、
的 ＲＥＶＥＩＬＬＥ ７￣ｌｉｋｅ １Ｆ 和 ＲＥＶＥＩＬＬＥ ７￣ｌｉｋｅ￣１Ｒ 引 乌拉图小麦(Ｔ. ｕｒａｒｔｕ)、大麦(Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ)、黑
物进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ可得到 １ ２５１ ｂｐ 左右的条带 麦草(Ｌｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅ)、硬直黑麦草(Ｌ. ｒｉｇｉｄｕｍ)、二
( 图 １ ) ꎬ 将 序 列 提 交 到 ＮＣＢＩ 上 比 对 可 知ꎬ 穗短柄草 ( Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ)、谷子 ( Ｓｅｔａｒｉａ
ＲＥＶＥＩＬＬＥ ７￣ｌｉｋｅ 基因序列全长 １ ７３５ ｂｐꎬ开放阅 ｉｔａｌｉｃａ ｖａｒ. ｇｅｒｍａｎｉｃａ)、柳枝稷( Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ)
读框( ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅꎬＯＲＦ) １ ２５１ ｂｐꎬ共编码 ＲＥＶＥＩＬＬＥ ７￣ｌｉｋｅ 蛋白的系统发育树ꎮ 由图 ２ 可知ꎬ
４１６ 个氨基酸ꎮ 小麦的 ＲＥＶＥＩＬＬＥ ７￣ｌｉｋｅ 蛋白和节节麦、 二粒小麦