Page 23 - 《广西植物》2020年第3期
P. 23
３ 期 李蜜等: 北部湾徐闻海域红树内生细菌物种多样性及其杀线虫活性研究 ３ ０ ３
养基上ꎬ倒置放置于 ２８ ℃ 恒温培养箱培养 ２ ~ ８
表 １ 样品采集信息
周ꎮ 通过形态观察挑取形态各异的单菌落使用改
Ｔａｂｌｅ １ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ
良 ＩＳＰ２ 固体培养基进行分离纯化ꎬ通过三区划线
样品编号 采集部位编号 纯化ꎬ获得纯净的单菌落ꎬ并记录菌落数及菌落的
植物种类
Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｃｏｄｅ ｏｆ
Ｐｌａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ 形态特征ꎮ 将纯化好的纯菌株用竹签刮取对数生
ｓａｍｐｌｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅ
长期的菌体ꎬ于 ２０％( Ｖ / Ｖ) 无菌甘油管中制成菌
Ａ 海莲 Ａ￣１
Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ ｓｅｘａｎｇｕｌａ Ａ￣２ 悬液于－８０ ℃ 超低温冰箱保藏ꎮ
Ａ￣３
１.２.４ １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因序列分析 菌株基因组 ＤＮＡ
Ｂ 桐花树 Ｂ￣１
Ａｅｇｉｃｅｒａｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ Ｂ￣２ 的提取采用 Ｃｈｅｌｅｘ￣１００ 树脂法(周双清等ꎬ２０１０)ꎬ
选取纯化好的菌株ꎬ用无菌竹签挑取芝麻粒大小
Ｂ￣３
Ｃ 红海榄 Ｃ￣１ 的菌体加入装有 ５０ μＬ Ｃｈｅｌｅｘ￣１００ 树脂的八连管
Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ ｓｔｙｌｏｓａ Ｃ￣２
中ꎬ用竹签充分搅拌使菌体与树脂混匀ꎬ进行 ＰＣＲ
Ｄ 海漆 Ｄ￣１
Ｅｘｃｏｅｃａｒｉａ ａｇａｌｌｏｃｈａ Ｄ￣３ 梯度扩增ꎮ
Ｅ 黄槿 Ｅ￣２ ＰＣＲ 梯度扩增参照 Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ. ( １９９１) 的方
Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｔｉｌｉａｃｅｕｓ Ｅ￣３
法ꎬ 扩 增 引 物 使 用 细 菌 通 用 引 物 ２７Ｆ ( ５′￣
Ｆ 阔苞菊 Ｆ￣２
Ｐｌｕｃｈｅａ ｉｎｄｉｃａ Ｆ￣３ ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ￣３′) 和 １４９２Ｒ ( ５′￣
ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ￣３′)ꎮ ＰＣＲ 产 物 利 用
Ｇ 白骨壤 Ｇ￣２
Ａｖｉｃｅｎｎｉａ ｍａｒｉｎａ Ｇ￣３ １％琼脂糖凝胶电泳检测ꎬＢｉｏ￣ＲＡＤ 凝胶成像仪观
察电泳目标条带的有无来作为判断基因组 ＤＮＡ 提
注: １. 根ꎻ ２. 茎ꎻ ３. 叶ꎮ
取是否合格ꎬ检验合格后将 ＰＣＲ 产物送至上海美
Ｎｏｔｅ: １. Ｒｏｏｔꎻ ２. Ｓｔｅｍꎻ ３. Ｌｅａｆ.
吉生物医药技术有限公司广州分公司进行测序ꎮ
盐－淀粉琼脂培养基)、Ｒ２Ａ( Ｒ２Ａ 琼脂培养基)ꎮ 测序 结 果 经 ＤＮＡ Ｓｔａｒ 软 件 整 理ꎬ 利 用 数 据 库
详细配方见李菲等(２０１６)ꎮ 培养基中添加重铬酸 ＥｚＢｉｏＣｌｏｕｄ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ. ｅｚｂｉｏｃｌｏｕｄ. ｎｅｔ/ ) ( Ｋｉｍ ｅｔ
钾和制霉菌素抑制真菌生长ꎬ终浓度分别为 ２５、５０ ａｌ.ꎬ ２００９) 进行在线比对ꎻ对 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因序列
ｍｇＬ ꎮ 待培养基温度降至 ５０ ℃ 左右时加入抑 进行相似性比对搜索ꎬ从中选取相似性较高且是
￣１
制剂ꎬ混匀倒于培养皿中制成固体培养基ꎮ 有效描述的典型菌株的 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因序列作为
纯化及保藏培养基:改良 ＩＳＰ２ 固体培养基ꎬ配 参比对象ꎮ
方为酵母提取物 ２.０ ｇꎬ麦芽提取物 ２.０ ｇꎬ葡萄糖 ２.０ １.３ 杀线虫活性测试
ｇꎬ琼脂粉 １５.０ ｇꎬ海盐 ３０ ｇ 和去离子水１ ０００ ｍＬꎮ １.３.１ 细菌发酵粗提物的制备 参 考 李 飞 娜 等
发酵培养基:改良 ＩＳＰ２ 液体培养基ꎬ培养基配 (２０１７)及覃媚等(２０１６) 的方法ꎬ将对数生长期的
方同改良 ＩＳＰ２ 固体培养基ꎬ但不加入琼脂粉ꎮ 细菌接种于 ２００ ｍＬ 改良 ＩＳＰ２ 液体培养基中ꎬ于
１.２.２ 红树植物样品的处理 采集的红树植物于 １８０ ｒｍｉｎ ２８ ℃ 摇床发酵 ７ ｄꎬ合并发酵液用等
￣１
无菌操作台中选取完整无病虫害的根、茎和叶不 体积的乙酸乙酯萃取ꎬ取乙酸乙酯层利用旋转蒸
同组织部位ꎮ 参考李家怡等(２０１７) 用 ５％次氯酸 发仪浓缩至浸膏状后备用ꎬ收集粗提物置干燥器
钠溶液浸泡 ８ ｍｉｎꎬ无菌水冲洗残余液体ꎻ７５％的酒 中 ４ ℃ 低温保存ꎮ
精溶液浸泡 ５ ｍｉｎꎬ无菌水冲洗至无酒精味ꎮ １.３.２ 细菌代谢产物的杀线虫实验 参考许敏等
取已处理的不同部位红树植物样品大约 ２ ｇ (２０１６)的方法ꎬ用红树内生细菌发酵液乙酸乙酯
于研钵充分研磨ꎬ２ ｍＬ 无菌水与研磨样品充分混 粗提物进行杀线虫活性实验ꎬ线虫致死率(％)＝ 线
匀ꎻ取 １ ｍＬ 该浓度液作为样品原液ꎬ再依次稀释 虫死亡数 / 线虫总数 × １００％ 来计 算ꎬ以 线 虫 致 死
￣３ ￣４
到 １０ 和 １０ 组织悬液ꎬ当做涂布的样液ꎬ置于 ４ 率>５０％为阳性结果ꎮ
℃ 冰箱暂存ꎮ １.３.２.１ 线虫产卵培养 将秀丽隐杆线虫挑至新鲜
１.２.３ 菌株的分离纯化及保藏 取上述组织悬液 的已加有 ＯＰ５０ 的 ＮＧＭ 培养基( Ｂｒｅｎｎｅｒꎬ１９７４) 中
１０ 和 １０ 稀释液 ０.２ ｍＬꎬ分别涂布于 １０ 种分离培 进行产卵培养ꎬ镜检培养皿产卵较多时收集线虫ꎮ
￣４
￣３
