Page 24 - 《广西植物》2020年第3期
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３ ０ ４ 广 西 植 物 ４０ 卷
１.３.２.２ 线虫的同步化 将线虫用 Ｍ９ 缓冲液进行 (Ａｅｇｉｃｅｒａｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ) 分离到假单胞菌属 １０ 株ꎬ
冲洗ꎬ于 ３ ０００ ｒｍｉｎ 离心 １ ｍｉｎ 弃去上清液ꎻ加 红海榄( Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ ｓｔｙｌｏｓａ) 获得 ６ 株无色杆菌属
￣１
入三倍体积的裂解液ꎬ上下颠倒震荡约 ５ ｍｉｎꎬ使 (Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ.)ꎮ 从总的菌株数量来看ꎬ优势
线虫表皮破裂ꎬ释放虫卵ꎬ以保证线虫裂解充分ꎬ 菌群为芽孢杆菌属ꎬ而不同样品分离得到的优势
￣１ 菌群不同ꎮ 通过 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因序列比对排重ꎬ最
于 ３ ０００ ｒｍｉｎ 离心 １ ｍｉｎꎬ弃去上清ꎻ加入 ２ ｍＬ
Ｍ９ 缓冲液冲洗ꎬ将裂解得到的虫卵加至涂有大肠 终获得 ３３ 株内生细菌ꎮ
杆菌 ＯＰ５０ 的 ＮＧＭ 培养基上ꎬ置于 ２８ ℃ 生化培养 根据 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因序列相似性小于 ９８.６５％
箱内培养 ３６ ｈ 左右ꎬ即可得到处于同一龄期的线 的菌株属于潜在新物种的归类原则( Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ.ꎬ
虫ꎬ用于杀线虫活性实验ꎮ ２０１４)ꎬ由表 ２ 可知ꎬ３３ 株内生细菌中存在 １０ 株潜
１.３.２.３ 杀线虫活性实验 依次在 ９６ 孔板中每孔 在的新种或者新属ꎮ 菌株 ＩＭＤＧＸ ４６４９ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅ￣
加入含线虫 Ｍ９ 缓冲液约 ２０ μＬ( 每 ２０ μＬ 约 ２０ ｔｏｓｐｏｒａ ｓｐ.、ＩＭＤＧＸ ４７４４ Ａｌｔｅｒｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ.、ＩＭＤＧＸ
条)ꎬ加入 ５ μＬ 甲醇溶解的细菌发酵液粗提物( 浓 ４９０８ Ａｓａｉａ ｓｐ.、ＩＭＤＧＸ ４６４５ Ａｕｒａｎｔｉｍｏｎａｓ ｓｐ.、ＩＭＤＧＸ
￣１
度 ５００ μｇｍＬ )ꎬ用 Ｍ９ 缓冲液补足至 １００ μＬ ４７３７ Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ.、ＩＭＤＧＸ ４０８８ Ｐａｃｉｆｉｃｉｍｏｎａｓ ｓｐ.、
后ꎬ置于 ２０ ℃ 培养箱中培养ꎬ２４ ｈ 后在体式显微 ＩＭＤＧＸ ４１４５ Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ.、ＩＭＤＧＸ ４７２５ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
镜下观察并记录线虫总数和死亡数ꎮ 虫体僵直ꎬ ｓｐ.、ＩＭＤＧＸ ４８５０ Ｓｗａｍｉｎｔｈａｎｉａ ｓｐ. 和 ＩＭＤＧＸ ４８２７－１
震荡 ３０ ｓ 仍僵直判定为线虫死亡ꎮ 设置 １ μｇ Ｃｅｄｅｃｅａ ｓｐ.与有效发表菌株 Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｏｓｐｏｒａ ｃｈｉａｎｇ￣
ｍＬ 阿维 菌 素 阳 性 组 和 ５％ 的 甲 醇 溶 液 阴 性 组 ｍａｉｅｎｓｉｓ、Ａｌｔｅｒｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｍａｒｅｎｓｉｓ、 Ａｓａｉａ ｓｉａｍｅｎｓｉｓ、
￣１
对照ꎮ Ａｕｒａｎｔｉｍｏｎａｓ ｃｏｒａｌｉｃｉｄａ、 Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｌｖｕｓ、
１.３.２.４ 线虫半数致死浓度(ＬＣ 值)的测定 加入 Ｐａｃｉｆｉｃｉｍｏｎａｓ ａｕｒａｎｔｉｕｍ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ａｅｓｔｕａｒｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏ￣
５０
７５ μＬ Ｍ９ 缓冲液至 ９６ 孔板ꎬ同时加入 ２０ μＬ 的线 ｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ、Ｓｗａｍｉｎｔｈａｎｉａ ｓａｌｉｔｏｌｅｒａｎｓ 和 Ｃｅｄｅｃｅａ
虫(每 ２０ μＬ ２０ 条)ꎮ 采用倍半稀释法ꎬ将 ２ 株活 ｌａｐａｇｅｉ 的 最 高 相 似 度 分 别 为 ９７. ９２％、 ９７.７６％、
性菌株 ＩＭＤＧＸ ４７４４ 和 ＩＭＤＧＸ ４７２５ 的乙酸乙酯 ９７.７４％、９８.０３％、９７.９２％、９７.５３％、９７.３８％、９７.８２％、
提取浓缩物分别用甲醇稀释成 １０ 个浓度梯度ꎬ取 ９８.０７％和 ９８.６３％ꎬ可能为潜在的新物种ꎮ
各个浓度 ５ μＬ 加入 ９６ 孔板ꎬ置于 ２０ ℃ ꎬ培养 ２４ ｈ ２.２ 红树植物内生细菌种和属数量分布
后观察并统计ꎮ 采用 Ｐｒｏｂｉｔ 法( 贾春生ꎬ２００６) 分 各样品分离到的细菌种和属的数量分布如图
别计算 ２ 株活性菌株的 ＬＣ 值ꎮ １ 所示ꎮ ７ 种红树植物中ꎬ桐花树样品分离到内生
５０
１.４ 统计分析 细菌共 １９ 株ꎬ隶属于 １６ 个属ꎻ海莲得到 １３ 株内生
线虫寿命数据采用 ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ２１.０ 进行统 细菌ꎬ隶 属 于 １０ 个 属ꎻ 红 海 榄 和 阔 苞 菊 均 为 １０
计分析ꎬ图 表 采 用 Ｅｘｃｅｌ ２０１３ 软 件 绘 制ꎬ细 菌 的 株ꎻ海漆和白骨壤均为 ７ 株ꎻ黄槿分离到 ６ 株ꎮ 不
１６Ｓ ｒＲＮＡ 基因序列利用 ＤＮＡ Ｓｔａｒ 软件进行整理ꎮ 同红树部位内生细菌多样性亦存在差异ꎬ桐花树
中分离得到的细菌种和属数量依次是根>茎>叶ꎬ
２ 结果与分析 根得到的种和属数量最多ꎬ远大于茎及叶ꎻ红海
榄、海漆和白骨壤不同部位中分离得到的细菌种
２.１ 红树植物内生细菌多样性分析 和属数量表现为根>茎ꎻ黄槿和阔苞菊中所得菌株
如表 ２ 所示ꎬ从红树植物共分离得到 ３３ 株内 数量差异不大ꎬ茎和叶的菌株数量基本保持一致ꎻ
生细菌ꎬ隶属于 ６ 个纲 １３ 个目 １９ 个科 ２３ 个属ꎮ 海莲的茎中获得的菌株种和属数量最多ꎬ根及叶
其中ꎬ芽孢杆菌属( Ｂａｃｉｌｌｕｓ) ３３ 株ꎬ占分离总菌数 基本保持相同数量的种和属ꎮ
的 ２０.３８％ꎬ为此次分离内生细菌的优势菌群ꎻ肠 ２.３ 不同培养基分离效果的差异
杆菌属(Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ)和假单胞菌属( Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ) 不同成分的培养基可以满足不同微生物的营
均为 ２１ 株 细 菌ꎬ 均 占 总 菌 数 的 １３. ４％ꎻ 泛 菌 属 养需求ꎬ培养基营养成分的差异严重影响微生物
(Ｐａｎｔｏｅａ)２０ 株ꎬ占分离总菌数的 １２.７％ꎮ 不同样 的生长ꎮ 由图 ２ 和表 ３ 可知ꎬＲ２Ａ( Ｒ２Ａ 琼脂培养
品其优势菌群存在差异ꎬ其中ꎬ海莲( Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ ｓｅ￣ 基)分离得到 ２７ 株细菌ꎬ隶属于 １１ 个属 １５ 个种ꎬ
ｘａｎｇｕｌａ)优势菌群为芽孢杆菌属(１５ 株)ꎬ桐花树 其培养基主要成分包括酵母浸出物、蛋白胨、 酪蛋
