Page 34 - 《广西植物》2020年第3期
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３ １ ４                                 广  西  植  物                                          ４０ 卷
                                                                                     ￣１
   ５０ ℃ 时 加 入 抑 制 剂 重 铬 酸 钾 使 其 终 浓 度 为 ２５           ２.５ ｇ 蛋白胨、１７ ｇ 琼脂、１ ｍｏｌＬ Ｋ ＨＰＯ －ＫＨ
                                                                                        ２    ４     ２
         ￣１                                          ＰＯ Ｂｕｆｆｅｒ (ｐＨ ＝ ６.０) ２５ ｍＬ、９７５ ｍＬ 蒸馏水进行灭
   ｍｇＬ ꎬ混匀ꎮ
                                                        ４
       纯化及保藏培养基:改良 ＩＳＰ２ 固体培养基ꎬ酵                      菌ꎮ 灭菌后加入抽滤除菌的 ５ ｍｇｍＬ 胆固醇溶液
                                                                                        ￣１
   母提取物 ２.０ ｇꎬ麦芽提取物 ２.０ ｇꎬ葡萄糖 ２.０ ｇꎬ琼                １ ｍＬ、１ ｍｏｌＬ ＭｇＳＯ １ ｍＬ、１ ｍｏｌＬ 的 ＣａＣｌ
                                                                                          ￣１
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   脂 ２０.０ ｇ 和海水 １ ０００ ｍＬꎮ                            １ ｍＬꎮ
       发酵培养基:ＩＳＰ２ 液体培养基ꎮ                             １.３.３ 秀丽隐杆线虫延缓衰老活性测试方法  真
   １. ２. ２ 红 树 植 物 样 品 的 处 理   参 考 李 家 怡 等           红树内生细菌代谢产物粗提物样品分两批次进行
   (２０１７)方法ꎬ对红树植物样品进行表面除杂和消                          线虫寿命实验ꎬ第一批次总共采集得到 １１ 个样品
   毒ꎬ５％次氯酸钠溶液浸泡 ８ ｍｉｎꎬ无菌水冲洗至没                        的寿命数据ꎬ样品详情如表 ４ 所示ꎬ第二批次总共
   有残留ꎻ７５％的酒精溶液浸泡 ５ ｍｉｎꎬ无菌水冲洗至                       采集得到 ８ 个样品的寿命数据ꎬ具体数据如表 ５
   无酒精ꎮ 取大约 ２ ｇ 的新鲜样品进行研磨ꎬ吸取 ２                       所示ꎮ
   ｍＬ 无菌水与样品混匀ꎬ该浓度液作为样品原液ꎬ                               实验步骤:用 Ｍ９ 缓冲液将虫体洗净离心弃上
   再用无菌水依次稀释到 １０ 和 １０ 组织悬液ꎬ置于                        清液ꎬ以 １ ∶ ３ 的比例加入裂解液(１ ｍＬ ５ ｍｏｌＬ            ￣１
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                                  ￣４
   ４ ℃ 冰箱暂存ꎮ                                         的 ＮａＯＨ 和 ０.５ ｍＬ ５％的 ＮａＣｌＯ 混匀使用)ꎬ震荡
   １.２.３ 菌株的分离纯化及保藏  取 １０ 和 １０ 组织                    离心后ꎬ分别加入 ２０ μＬ 大肠杆菌发酵液、３０ μＬ
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   悬液 ０.２ ｍＬꎬ分别涂布于 ９ 种不同成分的分离培                       线虫 ｐｅｌｌｅｔ、１５０ μＬ Ｍ９ Ｂｕｆｆｅｒ 于 ９６ 孔板的各个孔
   养基中ꎬ置于 ２８ ℃ 恒温培养箱培养 １４ ~ ３０ ｄꎻ通过                  中ꎬ设置阴性对照ꎮ 置于 ２０ ℃ 生化培养箱中培养
   形态观察ꎬ挑选表面光滑的单菌落在 ＩＳＰ２ 培养基                         ４８ ｈ 后可得 Ｌ４ 期线虫ꎮ 将培养好的 Ｌ４ 期线虫挑
   上进行三区划线纯化ꎬ如有杂菌则进行二次纯化                             至加有药液( 药液浓度 ５００ μｇｍＬ ꎬ每次加 ５０
                                                                                       ￣１
   或多次纯化ꎬ直至得到单一纯净的菌落ꎬ同时记录                            μＬ)的 ＮＧＭ 培养基上进行培养ꎬ每组 ２ 板ꎬ每板
   菌落数及菌落的形态特征ꎮ 纯化好的菌株制成                             ２０ 条ꎬ此时培养天数记为 ０ ｄꎮ 此后ꎬ隔天对培养

   ２０％(Ｖ / Ｖ)甘油管保藏于－８０ ℃ ꎮ                           基的线虫进行计数ꎬ每天观察并记录线虫生存、死
   １.２.４ ＰＣＲ 扩增和系统发育树分析  采用 Ｃｈｅｌｅｘ￣                  亡及剔除的数量ꎬ将线虫每 ２ ｄ 转移至新的培养
   １００ Ｒｅｓｉｎ 法(周双清等ꎬ２０１０) 提取基因组 ＤＮＡꎻ                 皿ꎬ直至线虫全部死亡ꎮ 得出平均寿命和最大寿
   并参照 Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ.(１９９１) 的方法进行 ＰＣＲ 梯度               命值ꎮ
   扩增ꎮ ＰＣＲ 产物用 １％琼脂糖凝胶电泳检测ꎬＢｉｏ￣                      １.４ 统计分析
   ＲＡＤ 凝胶成像仪成像观察电泳结果ꎮ 凝胶成像仪                              所有数据采用软件 ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ １７.０ 进行统
   检验条带合格后委托上海美吉生物医药技术有限                             计分 析ꎬ 并 用 软 件 Ｅｘｃｅｌ ２０１３ 做 表、 绘 图ꎬ 通 过
   公司广州分公司进行测序ꎮ                                      ＤＮＡ Ｓｔａｒ 软件进行序列整理ꎮ
       测序结果经 ＤＮＡ Ｓｔａｒ 软件整理ꎬ利用数据库
   ＥｚＢｉｏＣｌｏｕｄ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ. ｅｚｂｉｏｃｌｏｕｄ. ｎｅｔ/ ) ( Ｋｉｍ ｅｔ  ２  结果与分析
   ａｌ.ꎬ ２００９) 进行在线比对ꎻ对 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因序列
   进行相似性比对搜索ꎬ从中选取相似性较高且是                             ２.１ 红树植物内生细菌多样性分析
   有效描述的典型菌株的 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因序列作为                            根据菌落特征进行初步排重后ꎬ选择 ５８ 株菌
   参比对象ꎮ                                             进行 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因扩增和序列分析ꎬ结果表明 ３２
   １.３ 延缓衰老活性实验                                      株为细菌ꎬ分布于 ４ 个纲 １０ 个目 １２ 个科 １７ 个属ꎬ
   １.３.１ 红 树 林 细 菌 粗 提 物 的 制 备   参 考 覃 媚 等           其物种组成多样性分布如表 ３ 所示ꎮ ３２ 株红树林
   (２０１６)的方法:将 ３２ 株对数生长期的菌株接种于                       植物内生细菌在 １７ 个属的多样性分布如图 １ 所

   ２００ ｍＬ 液体培养基中发酵 ７ ｄꎬ离心收集发酵液ꎬ                      示ꎬ其中橙单胞菌属( Ａｕｒａｎｔｉｍｏｎａｓ)、短波单胞菌
   发酵液用乙酸乙酯萃取ꎬ取乙酸乙酯层浓缩备用ꎻ                            属(Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ)、甲基杆菌属(Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ)、鞘
   收集粗提物ꎬ置于干燥器中低温保存ꎮ                                 氨醇单胞菌属(Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ)、无色杆菌属(Ａｃｈｒｏ￣
   １.３.２ ＮＧＭ ( ｎｅｍａｔｏｄｅ ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ) 培养基的配         ｍｏｂａｃｔｅｒ)、柠檬酸杆菌属(Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ)、盐单胞菌属

   制  参考 Ｂｒｅｎｎｅｒ(１９７４) 的方法:加入 ３ ｇ ＮａＣｌ、              (Ｋｕｓｈｎｅｒｉａ)、Ｓａｌｉｎｉｃｏｌａ、沙雷氏菌属(Ｓｅｒｒａｔｉａ)、 根瘤
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