Page 37 - 《广西植物》2021年第6期
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ᤃ 期 张 艳 秋 等 ᧥ 盐角草内生真菌分离鉴定及抑制水产腐败细菌菌株的筛选 ऐ ऐ ጢ
性研究ᖔ并利用 ᧧ఋ୩ 基因序列对内生真菌进行鉴 唯智生物有限公司测序ᤥ
定ᖔ并评价了这些内生真菌抑制几种水产腐败细 ϓॹጇ 真菌次生代谢产物的提取和抑菌活性测定
菌的活性ᤥ 本研究对于北部湾耐盐植物内生菌资 接种真菌于 ԡԡ ቝᓂ 液体 ୩۪᧕ዶ 培养基ᖔԡԡ
᥋ϟ
源的开发具有较重要意义ᤥ ʢኼቝᔽႿ ᖔᤃ ጲ ऐ ቩ ᖔ发酵培养 ϟԡ ጲ ԡ ʛ 至菌丝体
长满三角瓶ᤥ ऐ ԡԡԡ ʢኼቝᔽႿ 离心收集菌丝体ᖔ常
᥋ϟ
ϟজ 材料与方法 温下风扇吹干水分ᤥ 干燥后的菌体称取 ԡሕ ੫ 加
入 ጢቝᓂ 提取液ྉ 乙酸乙酯 ᨒ 甲醇 ᨒ 乙酸 ᢉ ऐԡ ᨒ
ϓॹϓ 盐角草材料的采集 ϟጢ ᨒ ጢɯ浸泡ᖔ将提取液均匀吸入 ሕ 个 ጶ۪ 管ᖔ静置
盐角草全草采自北部湾钦州沿海月亮湾附近 待提取液挥发ᖔ在 ጶ۪ 管中分别加入有机溶剂石油
盐田ᖔ经专家鉴定为盐角草ྉ ᐹᤀᔠዞᅳʗႥᔠᐹ ᓣࣩʗᅳᡓᐹᓣᐹɯᤥ 醚ܦ乙酸乙酯和甲醇来溶解提取物ᤥ 抑菌活性指
采集的盐角草放入冰盒后迅速转移到实验室进行 示菌诺氏布丘氏菌ྉ ଧࣩᡙᡙᔠᐹࣩଝᓣᤀᤀᐹ Ⴅᅳᐹዞҧᔠᐹᓣɯܦ气单胞
下一步研究ᤥ 菌 ྉ ዛᓣʗᅳቂᅳႥᐹ ʐ၊ᐹҧᓣႥᔠ ɯܦ 乡间布丘氏菌
ϓॹԣ 培养基 ྉ ଧࣩᡙᡙᔠᐹࣩଝᓣᤀᤀᐹ ᐹצᔠႥᔠᐹᓣ ɯܦ 副溶 血 弧 菌 ྉ Ⴌᔠᤇʗᔠᅳ
内生真菌的分离培养基为 ୩۪᧕ዶ 培养基ᖔ是在 ᡓᐹʗᐹ၊ᐹᓣቂᅳᤀᡥᡙᔠዞࣩɯ分别来自腐败的鱼肉和其他水产
普通 的 ۪᧕ዶ 培养基 ྉ ᥈ᆍႿ੫ ᔀᡷ ᑕᖔ ԡϟᎮɯ 里添加 品ᖔ由本实验室分离保藏ᤥ 分别接种到 ᓂା 液体培
ϟጢᠮ的海水晶ଫ指示菌培养基为普通 ᓂା 培养基 养基中ᖔऐ ቩ 摇床上以 ԡԡ ʢኼቝᔽႿ 的转速培养过
᥋ϟ
ྉ胰化蛋白胨 ϟԡ ੫ᖔ酵母粉 ጢ੫ᖔ氯化钠 ϟԡ ੫ᖔ调 ᡱ̀ 夜ᤥ 将上述菌液 ԡԡ ဂᓂ 采用混菌法接种于培养
至 Ꭾ࿗ 左右ᖔ用纯净水定容至 ϟᓂɯᤥ 皿中ᖔ采用滤纸片法测定抑菌活性ྉ᥈ᆍႿ੫ ᔀᡷ ᑕᖔ
ϓॹᇺ 盐角草内生真菌的分离纯化 ԡϟऐɯᤥ 本实验使用滤纸片分别蘸取乙酸乙酯ܦ甲
自来水冲洗盐角草样品ᖔ按 ᥈ᆍႿ੫ ᔀᡷ ᑕྉԡϟᎮɯ 醇和乙酸作为空白对照ᖔ阳性对照为滤纸片蘸取
的方法进行样品表面消毒ᖔ用无菌水洗净后在超 ጢԡ ဂᓂኼቝᓂ 的卡那霉素和氯霉素ᤥ
᥋ϟ
净操作台中晾干ᤥ 无菌条件下将盐角草根ܦ茎和
জ 结果与分析
叶剪成 ԡጢ ዹቝ 的小段ᖔ置于 ୩۪᧕ዶ 培养基ྉ添加 ጢԡ
ဂ੫ኼቝᓂ 氯霉素ɯ 中ᤥ 倒置ᖔᤃ ጲ ऐ ቩ 培养ᖔ每天
᥋ϟ
观察ᖔ挑取长出的菌丝ᖔ在新的 ୩۪᧕ዶ 平板上生长ᖔ ԣॹϓ 盐角草内生真菌的分离结果
待菌落长出来后ᖔ挑取少量边缘的菌丝重复本操 从广西北部湾钦州沿海盐田边生长的盐角草
作 次对真菌进行纯化ᤥ 的根ܦ茎ܦ叶中共分离纯化得到 ࿗ऐ 株内生真菌ᖔ其
ϓॹ 内生真菌的分子鉴定 中茎中得到真菌 株ྉ 相同菌落形态的真菌合并
收集液体培养的内生真菌菌丝体ᖔ采用液氮反 为一种后共有 ጢ 株ᖔ命名为 ɟȮऊȮϟܦɟȮऊȮܦɟȮऊȮሕܦ
复冻融 ሕ 次ᖔ利用真菌 ᧕શዶ 提取试剂盒 ྉ 美国ᖔ ɟȮऊȮ࿗ 和 ɟȮऊ᥈ጢɯᖔ根中得到 ϟ 株ྉ 相同菌落形态
ᨃቝᔀ੫ᑕɯ 提取真菌的总 ᧕શዶྉ龚斌等ᖔԡϟᎮɯᤥ 合成 的真菌合并为一种后共有 ᤃ 株ᖔ命名为 ɟȮऊ᥈ϟܦ
୩ 系列随机引物ᖔ对引物进行筛选ᖔ选择稳定ܦ重复 ɟȮऊ᥈ܦɟȮऊ᥈ሕܦɟȮऊ᥈࿗ܦɟȮऊ᥈ጢ 和 ɟȮऊ᥈ᤃɯᖔ叶中得
性好的引物进行下一步实验ᖔ实验的具体步骤参考 到 ϟ࿗ 株ྉ相同菌落形态的真菌合并为一种后共有
龚斌等ྉԡϟᎮɯᤥ 内生真菌的 ᧧ఋ୩ 基因分析鉴定参考 ሕ 株ᖔ命名为 ɟȮऊɟϟܦɟȮऊɟ 和 ɟȮऊɟሕɯྉ表 ϟɯᤥ 由
᥈ᆍႿ੫ ᔀᡷ ᑕྉԡϟ࿗ɯ的方法ᖔ采用 ୩۪᧕ዶ 液体培养基培 表 ϟ 可知ᖔ从茎中分离的真菌是最多的ᖔ但是根中
养 ጢቝᓂ 真菌ᖔϟԡ ԡԡԡ ʢኼቝᔽႿ 离心 ጢቝᔽႿ 后收集菌 得到的真菌更为丰富ᤥ
᥋ϟ
丝体ᖔ用液氮冻融菌丝体 ሕ 次ᖔ用灭菌玻璃棒迅速将 ԣॹԣ ቴዛۗᦵ 分析内生真菌多样性
菌丝体研磨成匀浆ᖔ按照操作说明书采用真菌基因 对 ϟ࿗ 种菌落形态有差异的内生真菌ᖔ进一步提
组 ᧕શዶ 提取试剂盒ྉ ୩ᆍᑕʢᤦᔽᆍ 公司ɯ 提取真菌染色 取总 ᧕શዶ 后ᖔ进行 ዶ۪᧕ 多样性分析ྉ图 ϟɯᖔ通过
体 ᧕શዶᖔ提取的 ᧕શዶ 用 શᑕႿᆍ᧕ʢᆍᡱ ԡԡԡ 进行质量检 指纹条带分析ᖔ确定有 ᤃ 种不同的遗传类型ᖔ其中
测和定量ᖔ吸取一定量 ᧕શዶᖔ使用通用引物 ᧧ఋ୩ϟ 和 ɟȮऊɟϟܦɟȮऊȮϟܦɟȮऊȮሕܦɟȮऊȮ࿗ܦɟȮऊȮጢܦɟȮऊ᥈ϟܦɟȮऊ᥈ሕܦ
᧧ఋ୩࿗ 扩增真菌 ᧧ఋ୩ 基因片段ྉ᥈ᆍႿ੫ ᔀᡷ ᑕᖔ ԡϟጢɯᖔ扩 ɟȮऊ᥈࿗ܦɟȮऊ᥈ᤃ 相同ᖔɟȮऊȮ 和 ɟȮऊ᥈ጢ 分别为独立类
增出的片段经过 ۪ऊ 产物回收试剂盒回收后ᖔ送金 型ᖔɟȮऊ᥈ܦɟȮऊɟ 和 ɟȮऊɟሕ 相似但不完全相同ᤥ
