Page 99 - 《广西植物》2021年第7期

ϟ ϟ ԰ ऐ 广জ 西জ 植জ 物 ࿗ϟ 卷
ᡓႥᓣࣩቂᅳႥᔠᐹ ዶఋऊऊ ϟሕऐऐሕ ɯܦ 白色葡萄球菌 ԰ऐ ቩ ᖔ԰ԡԡ ʢኼቝᔽႿ 恒温振荡培养 Ꭾʛᖔ记录真菌的
᥋ϟ
ྉ ୒ᡙᐹᡓ၊ᡥᤀᅳዞᅳዞዞࣩ໧ ᐹᤀᤇࣩ໧ ϟԡ԰ँ ɯܦ 耻垢分枝杆菌 长势ܦ形态ܦ颜色等特征ᖔ加入等体积的乙酸乙酯
ྉ ᤹ᡥዞᅳᤇᐹዞᡙᓣʗᔠࣩቂ ໧ቂᓣ੖ቂᐹᡙᔠ໧ ϟԡሕᎮɯܦ 鲍曼不动杆菌 浸泡过夜后超声提取 ሕ 次ᖔ提取液减压浓缩回收
ྉዛዞᔠႥᓣᡙᅳᤇᐹዞᡙᓣʗ ᤇᐹࣩቂᐹႥᔠᔠ ዶఋऊऊ ϟँᤃԡᤃɯܦ 粪肠 球 菌 溶剂ᖔ用有机溶剂将样品转移至棕色样品瓶保存ᖔ
ྉጛႥᡙᓣʗᅳዞᅳዞዞࣩ໧ ஏᐹᓣዞᐹᤀᔠ໧ ዶఋऊऊ ԰ँ԰ϟ԰ɯܦሕ 株耐甲氧西 溶剂挥干后称取质量ᤥ
林金黄色葡萄球菌ྉᥘ኏୩ዶ ϟͱሕɯܦ԰ 株白色念珠菌 抑菌活性检测᧥病原细菌接种至液体 ᓂା 培养
᥋ϟ
的临床耐药菌ྉ ᧕ʢࣼ੫᥋ʢᔀ༁ᔽ༁ᡷᑕႿᡷ ࣷᐹႥʐᔠʐᐹ ᐹᤀᤇᔠዞᐹႥ໧ ϟ ͱ 基ᖔሕᎮ ቩ ܦ԰ԡԡ ʢኼቝᔽႿ 黑暗培养 ϟ԰ ၤᖔ白色念珠菌
᥋ϟ
԰ɯᤥ 以上供试菌株均由课题组前期研究保存ᤥ 接种至液体沙保氏培养基 ԰ऐ ቩ ܦ԰ԡԡ ʢኼቝᔽႿ 黑暗
ϟ঎ϟ঎࿗ 培养基জ 病原细菌培养基জᓂା᧥胰蛋白胨 ϟԡ 培养 ԰࿗ ၤᖔ 用液体培养基将各菌液分别稀释 至
ᤃ Ꭾ ᥋ϟ
੫ᖔ酵母提取物 ጢ੫ᖔ氯化钠 ϟԡ ੫ᖔ琼脂 ϟጢ ੫ᖔ水 ϟᓂᖔ ϟġϟԡ ጲϟġϟԡ ዹ஦ࣼኼቝᓂ 备用ᤥ
ᡱ̀ Ꭾ঎԰ ጲ Ꭾ঎ᤃᤥ 采用牛津杯扩散法ྉ 邵颖等ᖔ԰ԡϟ԰ɯ 对各菌株
真菌培养基জྉϟɯ沙保氏培养基᧥蛋白胨 ϟԡ ੫ᖔ 的发酵粗提物进行抑菌实验ᖔ将稀释后的指示菌
葡萄糖 ࿗ԡ ੫ᖔ琼脂 ϟጢ ੫ᖔ水 ϟ ᓂᖔᡱ̀ ᤃ঎ԡଫྉ԰ɯ۪᧕ዶ 培养 菌液均匀涂布在固体培养基上ᤥ 用丙酮溶解粗提
᥋ϟ
基᧥马铃薯 ԰ԡԡ ੫ ྉ煮沸 ԰ԡ ቝᔽႿ 后过滤ᖔ弃渣取汁ɯᖔ 物至质量浓度为 ԰ԡ ቝ੫ኼቝᓂ ᖔ分别取 ጢԡ ဂᓂ 进行
葡萄糖 ԰ԡ ੫ᖔ琼脂 ϟጢ ੫ᖔ水 ϟ ᓂᖔᡱ̀ ᤃ঎ԡጲᎮ঎ԡଫྉሕɯ۪᧕ା 活性检测ᖔ以 ጢԡ ဂᓂ 丙酮做空白对照ᖔ以等体积的
培养基᧥马铃薯 ԰ԡԡ ੫ ྉ煮沸 ԰ԡ ቝᔽႿ 后过滤ᖔ弃渣取 抗生素做阳性对照ྉ病原细菌以 ጢဂ੫ 万古霉素为
汁ɯᖔ葡萄糖 ԰ԡ ੫ᖔ水 ϟᓂᖔᡱ̀ ᤃ঎ԡጲᎮ঎ԡᤥ 阳性对照ᖔ白色念珠菌以 ԰ԡ ဂ੫ 两性霉素 ା 为阳
ϓॹԣ 方法 性对照ɯᤥ 白色念珠菌 ԰ऐ ቩ 培养ᖔ其余病原细菌
ϟ঎԰঎ϟ 内生真菌的分离与纯化জ 将植物样本在流 于 ሕᎮ ቩ 培养ᖔ恒温培养 ϟ԰ ၤ 后测量抑菌圈直径ᤥ
水洗净后ᖔ选择没有破损的叶片和茎ᖔ切成 ԰ዹቝ 左 ϟ঎԰঎ሕ 化学多样性检测জ 采用薄层层析色谱法检
右的小块ྉ段ܦ片ɯᖔ在 ጢԡᠮ乙醇中浸泡 ϟቝᔽႿ 后置 测内生真菌化学多样性ᤥ 取一定量样品加入适量
᥋ϟ
于 Ꭾጢᠮ乙醇中 ϟቝᔽႿଫ根使用 ԡ঎ϟԡᠮ ̀੫ऊ᤟ 处理 ϟϟ 的甲醇溶液ᖔ制备成 ጢቝ੫ኼቝᓂ 的样品ᖔ超声振荡
԰
ቝᔽႿᖔ茎使用 ԡ঎ϟԡᠮ ̀੫ऊ᤟ 处理 ᎮቝᔽႿᖔ叶使用 ԰ᠮ的 ሕԡ ቝᔽႿ 后ᖔ用 ԡ঎࿗ጢ ဂቝ 滤膜滤过ᤥ 用微量点样器
԰
શᑕऊ᤟ᨃ 处理 ጢቝᔽႿ 进行表面消毒ᖔ无菌水冲洗 ሕጲጢ 吸取适量样品ᖔ于 ᥈è԰ጢ࿗ 硅胶板ྉጢ ዹቝ ġ ϟԡ ዹቝɯ
次ᤥ 将材料切成 ԡ঎ጢ ዹቝ 左右的小块并将切口面接 上点样后ᖔ以氯仿 ᨒ 甲醇 ᢉ ϟԡ ᨒ ϟ 为展开剂展开ᖔ
入 ۪᧕ዶ 培养基ᖔ԰ऐ ቩ 恒温培养ᖔ待组织边缘长出 当所有样品展开高度达到 ࿗ዹቝ 时ᖔ将薄层板移出
真菌菌丝ᖔ挑取菌丝接种于 ۪᧕ዶ 培养基上ᖔ԰ऐ ቩ 晾干ᖔ观察ܦ标记色谱结果ᤥ 以各种显色条件下条
恒温培养进行反复纯化后ᖔ根据菌落形态ܦ菌丝长 带 ᣰ 斑点数较多ᖔ显色特异的样品对应的菌株记为
势及产色素情况进行菌株去重复ᤥ 同时ᖔ取最后 化学多样性好的菌株ᤥ
一次洗涤植物材料的无菌水 ԡ঎԰ ቝᓂ 涂布 ۪᧕ዶ 培 ϟ঎԰঎࿗ 优势菌株的分子鉴定জ 挑选抑制活性强且
养基ᖔ相同条件培养一周观察无菌丝生长证明表 化学多样性丰富的菌株培养 ሕʛ 后ᖔ刮取菌丝 ጢԡ ጲ
面消毒成功ᖔ所分离菌株为植物内生菌ྉ 杨明俊 ϟԡԡ ቝ੫ᖔ采用柱式真菌基因组 ᧕શዶ 提取试剂盒提
等ᖔ԰ԡϟ࿗ଫ侯晓群等ᖔ԰ԡϟጢɯᤥ 将纯化去重复所得菌 取真 菌 总 ᧕શዶᖔ 用真菌通用引物 ᧧ఋ୩ϟ ྉ ጢࣕ᥋
株每株接种 ሕጲጢ 只 ۪᧕ዶ 斜面ᖔ࿗ ቩ 保存ᖔ详细记录 ఋऊऊ᥈ఋዶ᥈᥈ఋ᥈ዶዶऊऊఋ᥈ऊ᥈᥈᥋ሕࣕɯ 和 ᧧ఋ୩࿗ ྉ ጢࣕ᥋
每株菌的分离源及其在固体和液体培养基中的形 ఋऊऊఋऊऊ᥈ऊఋఋዶఋఋ᥈ዶఋዶఋ᥈ऊ᥋ሕࣕɯ 进行 ᧧ఋ୩ 区域扩
态ܦ颜色和长势等信息ᖔ建立剑叶龙血树内生真菌 增ᤥ۪ऊ኏ 反应体系 ጢԡ ဂᓂ᧥ ఋ୩᧧શ᥈᣽ጶ ᥘᑕ༁ᡷᔀʢ ᥘᔽ଴
菌种库ᤥ ԰ጢ ဂᓂᖔ᧧ఋ୩ϟ ϟ ဂᓂᖔ ᧧ఋ୩࿗ ϟ ဂᓂᖔ ᧕શዶ ԰ ဂᓂᖔ ʛʛ̀ ᨃ
԰
ϟ঎԰঎԰ 优势菌株的筛选জ 内生真菌在 ۪᧕ା 培养基 ԰ϟ ဂᓂᤥ 反应程序᧥ँ࿗ ቩ 预变性 ሕቝᔽႿᖔ进入循环ᖔ
中培养 Ꭾʛᖔ采用牛津杯扩散法对发酵粗提物进行 ँ࿗ ቩ 变性 ϟቝᔽႿᖔጢጢቩ 复性 ࿗ጢ ༁ᖔᎮ԰ ቩ 延伸 ϟቝᔽႿᖔ
体外抑菌活性检测ᖔ并结合 ఋᓂऊ 结果及产量ᖔ筛选 共 ሕጢ 个循环ᖔᎮ԰ ቩ 延伸 ऐቝᔽႿྉ侯晓强等ᖔ԰ԡϟጢɯᤥ

出优势菌株ᤥ 扩增产物送至生工生物工程ྉ上海ɯ 股份有限公司
菌株发酵及提取᧥挑取经活化的内生真菌菌 测序ᤥ

丝或 孢子接种于 ϟԡԡ ቝᓂ ۪᧕ା 液体培养基中ᖔ 根据测序结果ᖔ进行 શऊା᧧ ᣰ ାᓂዶ୩ఋ 比对ᖔ搜索