Page 85 - 《广西植物》2023年第1期

１ 期 杨文婷等: 云南金铁锁根腐病病原菌的分离及鉴定 ８ １

格(杨丽云等ꎬ２０２０)ꎬ因此ꎬ极大地影响了金铁锁药 根据菌落大小、形态、颜色等特征去重复后接种于
材品质ꎬ很大程度上限制了云南白药等企业对金铁 ＰＤＡ 斜面－４ ℃ 保存ꎮ
锁资源的开发及利用ꎮ 然而ꎬ目前未见金铁锁根腐 １.２.２ 致病性测定
病的相关报道ꎬ严重影响了其防治工作的开展ꎮ 鉴 １.２.２.１ 病原菌分生孢子悬浮液的制备 将保留的
于此ꎬ本研究结合形态学观察及基因序列分析系统 菌种在 ＰＤＡ 平板上活化后转接至 ＰＤＢ 培养基中ꎬ
地鉴定了金铁锁根腐病的致病菌ꎬ首次发现尖孢镰 放在摇床上 ２８ °Ｃ 培养 ７ ｄꎬ然后将液体培养基中
刀菌是引起金铁锁根腐病的主要病原菌之一ꎬ研究 培养好 的 菌 株 用 ４ 层 纱 布 过 滤 除 去 菌 丝ꎬ５ ０００
结果可为下一步开展金铁锁根腐病生物防治功能 ｒｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎ 后ꎬ弃上清液ꎬ取沉淀物加入
￣１
菌株资源的挖掘奠定基础ꎬ并为金铁锁的病害诊断 适量 的 无 菌 水 摇 匀ꎬ 制 备 成 浓 度 约 为 １. ０ × １０ ６
￣１
和防治提供科学理论依据ꎮ ｃｆｕｍＬ 的孢子悬浮液备用ꎮ 孢子悬浮液的浓度
采用血球计数板法计算(张继忠和王薇ꎬ２０１８)ꎮ
１ 材料与方法 １.２.２.２ 病原菌的回接 组培苗接种病原菌:提前
准备好金铁锁组培苗ꎬ每个组培瓶里应具有 １０ 个
１.１ 材料 以上的金铁锁根ꎮ 使用注射器往金铁锁组培苗的
植物材料:金铁锁病害样品及健康植株(健康 须根周围接种 ５ ｍＬ 分生孢子悬浮液ꎬ重复接种 ６
样品和病害样品都为二年生金铁锁植株的根) 于 瓶ꎻ对照组采用同样方法接种 ５ ｍＬ 无菌水ꎬ重复
２０２０ 年 １１ 月采集于云南马龙ꎬ该地年均气温 １０ ~ 接种 ６ 瓶ꎬ然后室温中培养ꎬ观察组培瓶内金铁锁
２１ ℃ ꎬ年均降水量 ９７９.６ ~ １ ００１.８ ｍｍꎮ 该金铁锁 组培苗的变化ꎬ连续观察 １ 个月ꎮ
栽培基地的土质疏松肥沃ꎬ为金铁锁提供了良好 盆栽接种病原菌:前期把采回的二年生金铁
的生长条件ꎮ 金铁锁组培苗来自云南中医药大学 锁移栽置塑料花盆(直径 １９ ｃｍꎬ高 １９ ｃｍ) 内ꎮ 采
中药材优良种苗繁育工程中心ꎮ 用浸泡法接种ꎬ将健康金铁锁的根置于培养皿中ꎬ
主要试剂和仪器:马铃薯葡萄糖琼脂培养基 往培养皿中注入分生孢子悬浮液ꎬ浸泡 ０.５ ~ １ ｈ 后
(ＰＤＡ)(Ｓｏｌａｒｂｉｏꎬ生产批号为 ４２８Ｇ０３１)ꎬ马铃薯葡 倒出分生孢子悬浮液ꎬ处理后的根立即种于装有
萄糖肉汤(ＰＤＢ) (Ｓｏｌａｒｂｉｏꎬ生产批号为 ６０１Ｙ０３１)ꎬ 灭菌土的塑料花盆内ꎬ覆土ꎮ 对照处理用无菌水
萘啶酮酸 ( Ｓｏｌａｒｂｉｏꎬ 生产批号为 Ｙ７７４０８)ꎬ Ｔａｑ 酶 浸泡相同时间后立即栽种ꎮ 重复用分生孢子悬浮
(Ｔａｋａｒａꎬ生产批号为 ＡＬ５２０１４Ａ)ꎬ真菌 ＤＮＡ 小量提 液接种 ６０ 株金铁锁ꎬ然后正常的管理培养ꎮ 培养
取试剂盒(Ｍａｇｅｎꎬ生产批号为 ＤＫＩ０９￣０１)ꎮ 立式高 期间ꎬ观察盆栽中金铁锁苗的生长状况ꎬ待叶片枯
压灭菌锅(ＵｎｉｃｌａｖｅꎬＦＤ５０Ａ 型号)ꎬ超净工作台(苏 黄脱落后挖出金铁锁根ꎬ观察其是否烂根ꎮ 从发
净安泰ꎬＳＷ￣ＣＪ￣ＦＤ 型号)ꎬ生化培养箱 ( Ｂｌｕｅｐａｒｄꎬ 病植株的病健交界处再次进行病原菌分离ꎬ验证
ＬＲＨ￣７０ 型号)ꎬ生物显微镜( ＮｉｋｏｎꎬＥＣＬＩＰＳＥ Ｅ１００ 病原菌的致病性ꎮ
型号)ꎮ 测序引物由擎科生物(上海)科技有限公司 １.２.３ 病原菌的鉴定 形态学鉴定:将菌株接种于

合成ꎮ ＰＤＡ 培养基上进行活化ꎬ期间观察 ＰＤＡ 培养基上
１.２ 方法 的菌落的形态特征( 大小、颜色、形状的变化)ꎬ并
１.２.１ 病原菌的分离纯化 取有根腐病症状的根 用接种针挑取少量菌丝放置于载玻片上ꎬ加入几

的病健交界处组织ꎬ在 ５％ＮａＣｌＯ 中表面消毒 １.５ 滴无菌水ꎬ盖上盖玻片制成临时装片ꎬ采用 Ｎｉｋｏｎ
ｍｉｎꎬ然后在 ７５％酒精中表面消毒 １.５ ｍｉｎꎬ无菌水 生物显微镜ꎬ在１ ０００倍镜下观察分生孢子的形状、
冲洗 ２ ~ ３ 次ꎬ无菌滤纸吸干水分ꎬ用无菌剪刀在根 大小、厚垣孢子的有无及着生方式ꎮ 分子生物学
样品的病健交接处剪 １ / ３ 指甲盖大小的组织ꎬ将 鉴定:将病原菌接种到 ＰＤＡ 培养基上ꎬ待菌丝长至
￣１ 旺盛ꎬ挑取适量菌丝体于 １.５ ｍＬ 无菌管中ꎬ采用真
有切口的一面贴到含 ５０ ｍｇＬ 萘啶酮酸的 ＰＤＡ
培养基上(５０ ｍｇＬ 萘啶酮酸可选择性抑制细菌 菌 ＤＮＡ 小量提取试剂盒进行病原菌 ＤＮＡ 提取ꎮ
￣１
生长)ꎬ并在 ２８ °Ｃ 下培养 ２ ~ ３ ｄꎬ待染病组织块周 对 病 原 菌 ＤＮＡ 进 行 内 转 录 间 隔 区 ( ｉｎｔｅｒｎａｌ
围长出菌丝时ꎬ用接种针挑取菌落边缘尖端菌丝 ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒꎬ ＩＴＳ ) 和 转 录 延 伸 因 子￣１α
进行纯化ꎬ并观察菌落形态ꎮ 多次纯化后的菌株 (ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ￣１αꎬＴＥＦ￣１α)的扩增ꎮ