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瑶药红牛膝为苋科植物柳叶牛膝（Achyranthes longifolia）的根及根茎，始见成书于公元1436年的《滇南本草》（兰茂，1959）。近代本草《中药大辞典》（南京中医药大学，2006）、《中华本草》（国家中医药管理局中华本草编委会，1999）将“柳叶牛膝”收载于“土牛膝”项下，作为土牛膝的一个基原。
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红牛膝在广西各地及我国南北各省均有分布，生于山坡、沟谷、村旁，庭园亦有栽培，恭城药市上常有交易（林春蕊等，2016），在广西瑶族地区使用广泛，瑶语称之为“照脑咪”。《新编中药志》（肖培根，2002）、《广西恭城瑶族端午药市药用植物资源》（林春蕊等，2016）、《广西植物名录》（覃海宁和刘演，2010）等均对红牛膝有记载。广西恭城瑶族地区的瑶医多以根入药，瑶医认为其味苦、酸，性平，具有活血散瘀，祛风除湿，清热解毒，利尿功效，常用于治小儿感冒高热、肺炎咳嗽、尿路感染、肾炎、风湿性关节炎、腰膝酸痛、脚气水肿、闭经、产后腹痛、跌打损伤、鸡骨鲠喉、竹木刺伤、蜂蜇伤（覃迅云等，2002），其疗效良好，具有较好的开发前景。
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红牛膝现收载于地方标准《江西省中药饮片炮制规范》（江西省食品药品监督管理局，2009）中，其标准指标有性状、鉴别（粉末显微鉴别）、检查检验项目（水分、总灰分、酸不溶性灰分），但缺少药材横切面、薄层色谱鉴别、含量测定等重要的定性定量检测指标。同时，柳叶牛膝与同属植物土牛膝（A.bidentata）、粗毛牛膝（A. aspera）、钝叶土牛膝（A. aspera var. indica）的原植物形态相似，生长环境相同，各地存在混用情况（南京中医药大学，2006）。为区分鉴别药材真伪，正确评价药材质量优劣，确保临床用药安全有效，有必要制订可有效控制瑶药红牛膝药材质量的标准，为红牛膝药材的真伪鉴别和质量评价提供法定依据。
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红牛膝主要含有皂苷、生物碱、强心苷、三萜类化合物、甾体化合物、挥发油及有机酸等化学成分（国家中医药管理局中华本草编委会，1999）。其中，β-蜕皮甾酮是其主要活性成分之一，具有促进蛋白质合成（Gorelick-Feldman et al.，2008），抗心律失常（吴旭等，2002），抑制上皮细胞凋亡保护心肌（吴旭，2006；夏西超等，2013），抑制血糖上升（张庆远等，2015），通经活络、除湿镇痛等作用（王景富，2017），可治疗骨质疏松症（于大永等，2011；汤样华等，2019；赵强，2021；章喻等，2022）。对红牛膝中β-蜕皮甾酮进行含量测定，可作为红牛膝内在质量的控制方法。本研究采集广西不同产地红牛膝样品，完善红牛膝的性状鉴别，显微特征鉴别，TLC采用对照药材、化学对照品定性鉴别，通过HPLC法定量分析β-蜕皮甾酮的含量，为其药材质量标准的提高奠定基础，以便更加系统、科学地评价该药材的品质。
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1 材料与方法
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1.1 仪器和试剂
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仪器： LC-20AT高效液相色谱仪（岛津公司），1260 高效液相色谱仪（Agilent科技公司）；KQ-300DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；XS205电子分析天平（精度：十万分之一）（METTLER TOLEDO）；Master-S15超纯水机（上海和泰仪器有限公司）；Olympus BH-2 生物显微镜、Olympus DP20 照相系统（日本奥林巴斯株式会社）；YOKO-ZS薄层色谱成像仪（武汉药科新技术开发有限公司）。
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试剂： β-蜕皮甾酮对照品（来源于中国食品药品检定研究院，批号为111638-201907，含量为98.3%）；人参皂苷R0对照品（来源于中国食品药品检定研究院，批号为111638-201907，含量为98.3%）；乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；硅胶G板[默克化工技术（上海）有限公司，批号为HC39961356；青岛海洋化工有限公司，批号为20150312；烟台市化学工业研究所，批号为120829]；其余试剂为分析纯。
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1.2 药材
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在广西各地共收集14批不同产地的红牛膝药材样品（表1）。其中，8号样品制成腊叶标本（图1），经广西中医药大学韦松基教授、广西中医药研究院黄云峰副研究员鉴定，为苋科植物柳叶牛膝（Achyranthes longifolia），取8号样品作为本研究的对照药材。
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1.3 方法
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1.3.1 红牛膝的性状鉴别
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对红牛膝的根及根茎的大小、形状、表面、质地、断面及气味等特征进行观察与描述。
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1.3.2 红牛膝的显微鉴别
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将红牛膝根经固定液固定后按石蜡切片法切片染色制片，在生物显微镜下观察红牛膝根横切面的显微特征；将红牛膝根经干燥、粉碎，过药典四号筛，取粉末少许置载玻片上，用水合氯醛透化、装片，观察粉末的显微特征。
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1.3.3 红牛膝的薄层色谱鉴别
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取红牛膝药材粉末4 g，加乙醇50 mL，加热回流3 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水15 mL，微热使其溶解，加在D101型大孔吸附树脂柱（内径1.5 cm，柱高15 cm）上，用水100 mL洗脱，弃去水液，再用20%乙醇100 mL洗脱，弃去洗脱液，继续用80%乙醇100 mL洗脱，收集该洗脱液，蒸干，残渣加80%甲醇溶解定容至1 mL，作为供试品溶液；另取红牛膝对照药材4 g，同上面的方法制成对照药材溶液；再取β-蜕皮甾酮对照品、人参皂苷RO对照品适量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的混合溶液，作为对照品溶液。对照薄层色谱法（《中国药典》2015年版四部通则 0502）试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各2 μL、对照品溶液1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸（8∶2∶1∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃下加热至斑点清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视。
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1.3.4 β-蜕皮甾酮含量测定
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色谱条件如下：色谱柱为飞诺美Gemini-NX C18色谱柱；流动相为乙腈-水溶液（15∶85）；柱温为25℃；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为243 nm；进样量为10 μL。理论板数按β-蜕皮甾酮计算值不低于2 000。
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图1 柳叶牛膝腊叶标本图
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Fig.1 Specimen of Achyranthes longifolia
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对照品溶液的制备：取β-蜕皮甾酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液，作为对照品溶液。
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供试品溶液的制备：采用 L9（34）正交试验表，考察提取溶剂用量（10、20、30 mL）、加热回流提取时间（30、60、90 min）及甲醇浓度（60%、80%、100%）对红牛膝药材中β-蜕皮甾酮含量提取得率的影响。取红牛膝药材粉末（过二号筛）1 g，精密称定，按表2进行供试品制备，放置室温，称重，用相应浓度的甲醇补足减少的重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液，进样分析。根据正交结果筛选最合适的供试品溶液制备方法。
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专属性试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，待测定。同时做溶剂空白。
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线性关系考察 取β-蜕皮甾酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为560.6 μg·mL-1的溶液。分别精密吸取以上对照品溶液0.1、0.2、1、2、4 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为标准曲线的系列溶液，按上述色谱条件进行分析，以对照品的进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
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精密度试验 精密称取红牛膝样品（编号：10），制成供试品溶液，连续进样测定6次，记录β-蜕皮甾酮峰面积并计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。
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重复性试验 精密称取红牛膝样品（编号：10）粉末6份，制成供试品溶液，测定β-蜕皮甾酮含量。
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稳定性试验 取同一份供试品溶液（编号：10），在0、1、6、12、18、24 h下进样测定，记录β-蜕皮甾酮峰面积并计算相对标准偏差（RSD）。
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加样回收率试验 取已知含量的红牛膝样品（编号：10）粉末6份，各0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，各精密加入上述β-蜕皮甾酮对照品溶液560.6 μg·mL-1 1 mL，另精密加入甲醇19 mL，制成供试品溶液，测定β-蜕皮甾酮含量，计算回收率及RSD值。
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耐用性试验 分别采用Gemini-NX C18、Amethyst C18-H和依利特C18 3根不同品牌的色谱柱（规格均为 5 μm，4.6 mm × 250 mm）测定样品（编号：10）中β-蜕皮甾酮的含量，计算RSD值。采用Agilent 1260和岛津LC 20AT两个不同品牌的色谱仪，测定样品（编号：10）中β-蜕皮甾酮的含量，计算相对平均偏差（relative average deviation，RAD）值。
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14批红牛膝药材样品含量测定：根据上述供试品溶液制备条件项下正交试验结果确定的方法，制备14批红牛膝药材样品的供试品溶液；根据上述色谱条件及测定方法测定14批红牛膝药材样品的β-蜕皮甾酮含量（以药材干燥品计算）。
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2 结果与分析
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2.1 性状鉴别
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经对不同产地红牛膝药材性状进行观察，归纳总结出其药材性状如下：根茎短粗，长2~6 cm，直径1~1.5 cm，上部有数个凹窝状茎痕或残留茎基，下部簇生根 4~9 条或更多；根呈圆柱形，常扭曲，长10~20 cm，直径0.4~1.2 cm，向下渐细；表面灰黄褐色至棕褐色，具细密的纵皱纹及须根除去后的痕迹；质硬而稍有弹性，易折断，断面皮部淡灰褐色，略光亮，可见多数点状散布的维管束；气微，味微甜、微涩（图2）。
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图2 红牛膝药材图
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Fig.2 Medicinal materials of Hongniuxi
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2.2 显微鉴别
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经对不同产地红牛膝药材横切面和粉末的显微结构进行观察，归纳总结出其药材显微特征如下。
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2.2.1 根横切面特征
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木栓层细胞2~5列，部分已经脱落。栓内层细胞数列，类圆形。维管束外韧型，束间形成层不明显；异型维管束断续排列成3~5轮同心环，外部的维管束较小，木质部导管1~5个，向内维管束较大，导管较多；中央正常维管束，初生木质部二原型，导管单个或几个相连呈放射状分布，直径30~185 μm，射线细胞5~10列。薄壁细胞中含草酸钙砂晶或方晶，直径3~28 μm（图3）。
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图3 红牛膝根横切面
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Fig.3 Transverse section of Hongniuxi root
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2.2.2 根的粉末鉴别
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红牛膝根粉末呈灰黄色。木纤维较长，壁微木化，胞腔大，有的具斜形单纹孔，纤维直径12~28 μm；导管为网纹或梯纹导管，直径25~58 μm；草酸钙砂晶或方晶多散在，直径3~15 μm；木栓细胞多角形或类方形，灰黄色（图4）。
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2.3 薄层色谱鉴别
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供试品TLC色谱中，在对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点。见图5。
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2.4 方法学考察和含量测定
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2.4.1 供试品溶液制备方法的确定
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试验结果表明，溶剂用量（A）、加热回流提取时间（B）、甲醇浓度（C）3个因素对β-蜕皮甾酮得率的差异均无统计学意义（P均大于0.05），其中D为空白列（表3，表4）。经高效液相色谱分析发现，甲醇浓度为60%和80%时，样品检出的色谱峰较多，容易干扰到β-蜕皮甾酮的分离测定；溶剂用量少，过滤时挥发易造成测定结果误差变大；提取时间过短，测得结果稍低，提取时间过长，易导致效率低。综合以上因素，最终选择A2B2C3作为提取工艺，即取红牛膝药材粉末（过二号筛）1 g，精密称定，精密加入甲醇20 mL，称定重量，加热回流60 min，放至室温，再称定重量，用甲醇补足减少的重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液，作为供试品溶液。结果见表3和表4。
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图4 粉末显微图
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Fig.4 Powder micrograph
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图5 红牛膝药材 TLC 色谱图
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Fig.5 TLC chromatogram of Hongniuxi medicinal materials
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前期预实验在C因素水平不变的情况下，因素A与因素B不同水平间的交互作用曲线趋于平行，没有相交；在A因素水平不变的情况下，因素B与因素C不同水平间的交互作用曲线趋于平行，没有相交。因此，本研究没有考虑不同因素间的交互作用。
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2.4.2 专属性试验
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空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液色谱图见图6。供试品溶液色谱图中欲测成分β-蜕皮甾酮色谱峰与其他杂质峰分离较好，分离度大于1.5；二极管阵列检测器纯度分析显示，欲测成分β-蜕皮甾酮峰的纯度均大于0.999且均大于其单点阈值，说明该色谱峰纯度较高；空白溶剂无干扰。表明专属性良好。
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2.4.3 线性关系考察
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β-蜕皮甾酮对照品进样量在5.606~224.224 μg范围时，进样量与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为y=13.462 1x+5.237 7，r=0.999 9。
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2.4.4 精密度试验
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连续测定6次β-蜕皮甾酮峰面积平均值为747，RSD=0.41%，表明仪器的精密度良好。
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2.4.5 重复性试验
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6 份供试品测得β-蜕皮甾酮含量的平均值为0.119%，RSD=2.14%，表明供试品的制备方法重复性良好。
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2.4.6 稳定性试验
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24 h内同一供试品溶液的β-蜕皮甾酮峰面积的RSD为1.27%，表明样品在24 h内稳定。
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注: F0.05（2，2）=19.00。
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Note: F0.05 (2, 2) =19.00.
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图6 空白溶剂（A）、 β-蜕皮甾酮对照品（B）和供试品（C）HPLC色谱图
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Fig.6 Chromatogram of blank solvent (A) , β-ecdysterone reference substance (B) and sample for test (C)
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2.4.7 加样回收率试验
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6份样品测得β-蜕皮甾酮平均加样回收率为97.68%，RSD=1.37%（n=6），表明方法准确度好（表5）。
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2.4.8 耐用性试验
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3根色谱柱测得含量平均值为0.120%，RSD=1.02%（n=3）；2台色谱仪测得含量平均值为0.121%，RAD=0.50%（n=2）。结果表明，该方法对不同品牌的色谱柱和液相色谱仪均具有良好的耐用性，说明该方法对不同色谱柱和不同仪器的适用性强。
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2.4.9 14批样品含量测定结果
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β-蜕皮甾酮含量范围为0.005%~0.158%，平均值为0.095%（表6）。根据测定结果，并考虑不同产地药材来源差异情况，拟定红牛膝药材中β-蜕皮甾酮含量限度为≥0.050%。
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3 讨论与结论
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民族药质量标准是民族药发展的重要因素，标准化是民族药发展的趋势。由于历史原因，过去民族药标准化工作虽然取得了一定的成绩，但是整体水平偏低，无法满足临床用药的质量安全和民族药产品的开发需求。因此，开展和提高民族药质量标准的研究，对于规范民族药资源的开发、生产、流通，民族药产品质量的稳定以及临床用药具有重要意义，也为药材监管提供了技术依据。
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薄层色谱鉴别研究中发现，β-蜕皮甾酮、人参皂苷RO在样品中含量较高、专属性强，可作为特征性成分。选用不同的薄层板，即硅胶H薄层板、高效硅胶H薄层板、硅胶G薄层板、高效硅胶G薄层板，经过比较发现硅胶G薄层板展开效果较好，特征成分斑点分离效果较好，条带比较清晰，所以采用硅胶G薄层板；展开剂比较了乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸（8∶2∶1∶0.2）、正丁醇-乙酸乙酯-甲酸-水（6∶4∶1∶5）的上层溶液，发现采用乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸（8∶2∶1∶0.2）作为展开剂，分离效果良好，样品在对照药材和β-蜕皮甾酮、人参皂苷RO相应位置上显相同颜色的斑点，重复性良好，专属性强。同时考察了不同品牌的硅胶G薄层板，并在不同温度（4℃和30℃）和不同湿度（相对湿度55%和88%）下试验，特征成分斑点分离效果均较好，方法耐用性好。上述方法可作为红牛膝鉴别的主要依据。
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β-蜕皮甾酮为红牛膝主要有效成分之一，为更全面地反映饮片质量，本研究测定了β-蜕皮甾酮含量。在用HPLC进行含量测定方法的研究中，笔者曾对加热回流提取和超声提取制备供试液β-蜕皮甾酮含量进行比较，结果表明加热回流提取液测得的β-蜕皮甾酮含量高于超声提取；还分别对甲醇和乙醇作为提取溶剂加热回流提取制备供试液β-蜕皮甾酮含量进行比较，结果表明甲醇提取液β-蜕皮甾酮含量较乙醇提取液高。故本方法采用甲醇加热回流的方法制备供试品溶液。方法学研究表明，本文建立的红牛膝中β-蜕皮甾酮测定方法专属性强，无溶剂干扰，精密度和准确度高，具有良好的重复性和重现性，可用于评价瑶药红牛膝质量的优劣。
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本研究考察了红牛膝的性状鉴别、显微鉴别、薄层鉴别、含量等检查项目，并建立了红牛膝中β-蜕皮甾酮HPLC含量测定方法，可为红牛膝质量标准的完善与提高提供依据，为红牛膝的质量控制和开发应用提供参考。
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摘要
瑶药红牛膝为苋科植物柳叶牛膝(Achyranthes longifolia)的根及根茎，为瑶族地区习用药材，目前仅有个别省区收载了其质量控制方法。该文对广西壮族自治区区内采集的14批红牛膝药材进行了性状鉴别、显微鉴别和薄层色谱鉴别，并采用飞诺美Gemini-NX C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），以乙腈-水溶液（15∶85）进行等度洗脱，柱温25 ℃，流速1.0 mL·min-1，检测波长243 nm，建立红牛膝中β-蜕皮甾酮的HPLC含量测定方法。结果表明：（1）红牛膝药材性状、显微鉴别特征明显，显微鉴别可见栓内层、维管束、异常维管束、导管、射线细胞、草酸钙砂晶或方晶等。（2）薄层色谱分离好，β-蜕皮甾酮和人参皂苷RO对应的斑点清晰。（3）含量测定中，β-蜕皮甾酮在5.606~224.224 μg范围内线性关系良好（r=0.9999），平均加样回收率为97.68%，RSD为1.37%(n=6)。（4）14批样品中β-蜕皮甾酮含量为0.005%~0.158%，平均含量为0.095%。该研究建立了完整的显微鉴别、薄层鉴别及含量测定方法，为合理评价红牛膝质量和临床合理用药提供科学依据。
Abstract
Yao medicine Hongniuxi is the root and rhizome of Achyranthes longifolia, which is a commonly used medicinal herb in Yao ethnic areas. Currently, only a few provinces and regions have recorded the method for quality control of Hongniuxi. Microscopic method and thin layer chromatography (TLC) were qualitatively identified on the roots and rhizomes of 14 batches of Yao Medicine Hongniuxi collected in Guangxi Zhuang Autonomous Region in the study. The content of β-ecdysterone was determined by high performance liquid chromatography (HPLC). The Phenomenex column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) was used, the mobile phase was acetonitrile-water (15∶85) , the column temperature was 25 ℃, the flow rate was 1.0 mL·min-1, and the detection wavelength was at 243 nm. The results were as follows: (1) The character and microscopic identification methods of Hongniuxi were obvious. Microscopic identification showed the inner layer of thrombus, vascular bundle, abnormal vascular bundle, duct, ray cell, calcium oxalate sand crystal or square crystal, etc. (2) The TLC identification spots of β-ecdysterone and ginsenoside RO were clear, and the separation effect was good. (3) The β-ecdysterone showed a good linear relationship within the range of 5.606-224.224 μg (r=0.9999), whose average recovery (n=6) was 97.68%, with the RSD of 1.37%. (4) Among 14 batches of samples, the contents of β-ecdysterone ranged from 0.005% to 0.158%, with an average content of 0.095%. This study establishes a complete method for microscopic identification, thin layer identification, and content determination, providing a scientific basis for rational evaluation of the quality of Hongniuxi and clinical rational drug use.
