糯高粱胚乳中支链淀粉含量较高，蒸煮后黏性强，是酿造优质白酒的重要原料（丁延庆等，2019）。高粱产量的提高离不开肥料的使用，氮肥是高粱增产的主要因素，磷肥次之。然而，持续的高化肥投入会造成肥料利用效率降低、土壤环境破坏、水体污染等问题（陈同斌等，2002；董二伟等，2012）。微生物有机肥既能增加植物养分的供应量、促进植物生长、提高产量、改善农产品品质及农业生态环境，也能减轻植物病虫害、减少化肥使用量。因此，微生物有机肥在可持续农业战略发展中的地位日趋重要（李西强等，2013）。植物内生菌存在于植物的根、茎、叶、树皮、花和种子里，对植物的健康和发育有良好的促进作用（Dudeja et al.，2011; Santoyo et al.，2016）。叶内生菌主要是通过垂直传播和水平传播的方式获得（Balint et al.，2013），叶片的内部组织是一个吸引大量细菌和真菌的环境，含有丰富的微生物资源（Vandenkoornhuyse et al.，2015）。宿主植物为内生菌提供持续的营养供应，作为回报，内生菌通过磷酸盐溶解、氮固定、植物生长激素吲哚乙酸（IAA）产生、铁载体产生、ACC（1-氨基环丙烷-1-羧酸）水解酶合成等促进植物对营养元素的吸收，直接或间接促进植物生长（Cueva-Yesquén et al.，2021）。植物内生细菌与寄主植株在长期共同进化过程中形成了密切的相互关系，成为化肥和其他微生物制剂的最佳竞争者，其合理应用将减少化学农药和肥料对环境的污染，有利于保持生态平衡（梁志超等，2019）。

IAA属于植物生长素家族中的吲哚衍生物，是调节植物各种发育和生理过程的主要激素（Nutaratat et al.，2015），能够刺激细胞分裂、细胞伸长、细胞分化、光和重力响应、调节叶片掉落和果实成熟等（Teale et al.，2006）。因此，植物内生菌的IAA产生能力被认为是促进植物生长的关键指标。本研究以酿酒用的糯高粱红缨子品系为材料，采用LB培养基分离叶内生菌，利用Salkowski试剂检测菌株的IAA产生能力，结合16S rDNA测序分析对菌株进行分子生物学鉴定，并综合种子萌发实验和糯高粱盆栽实验评价菌株对糯高粱的促生长能力，从而获得对糯高粱生长有促进作用的微生物菌株，并对微生物菌株的促生长机制进行初步探究，以期为进一步开发促糯高粱生长菌剂提供种质资源。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为贵州省茅台镇酱香型白酒酿造用糯高粱，糯高粱品种为‘红缨子’，来自仁怀市丰源有机高粱育种中心。

1.2 方法

1.2.1 内生菌的分离纯化

称取10 g糯高粱幼苗的叶片，先用无菌剪刀剪成小块后进行表面消毒（70%乙醇2 min，5%次氯酸钠5 min，70%乙醇2 min，无菌水冲洗3次），再将叶片剪碎，转移到90 mL无菌水中，旋涡振荡30 min，作为菌悬液母液。将菌悬液用无菌水逐级稀释到10^-1、10^-2和10^-3 三个浓度梯度，分别从各个浓度梯度菌悬液中吸取100 μL到LB固体平板上，涂布均匀。在30℃培养箱中倒置培养72 h。挑取LB平板上长出的单菌落，用分区划线法对菌株进行纯化，将纯化好的菌株用终浓度为30%的甘油进行保藏。

1.2.2 IAA产生能力的测定

将菌株接种于R2A液体培养基中，30℃ 150 r·min^-1条件下培养4 d后，测定菌悬液在λ=600 nm处的吸光值。将培养好的菌悬液置于离心机中，5 000 r·min^-1离心10 min。取上清液10 mL，加入等体积的Salkowski比色液，避光静置30 min后，测定混合液在λ=530 nm处的吸光值。通过IAA浓度标准曲线计算IAA的产生量，并计算菌体浓度OD_{600 nm}为1时，菌株单位浓度IAA的产生量（何建清等，2019）。

1.2.3 菌株的分子生物学鉴定

用改良月桂酸钠法提取菌株的基因组DNA，用细菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGT TACCTTGTTACGACT-3′）扩增菌株的16S rDNA片段，将PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，将测序得到的16S rDNA序列信息与NCBI的GenBank数据库进行比对，下载与菌株16S rDNA同源性较高模式菌株的16S rDNA序列，利用MEGA 11软件中ClustalW 1.6程序进行序列比对，使用ModelTest 3.7结合PAUP*4.0v10b用于计算贝叶斯推断树最优构建模型，模型选取采用Akaike信息准则（Posada &Crandall，1998）。使用MrBayes 3.1.2软件构建贝叶斯推断树，建树过程采用Metropolis-coupled Markov chain Monte Carlo（MCMCMC）算法，设置1条冷链3条热链抽取随机树，并运行运算2次，共设置2 000 000代，每1 000代取1次样，运算收敛（平均分裂标准差＜0.01）后得到2 000个树的后验分布。剔除前25%（共500个）分布不稳定的样本树，留下后75%（共1 500个）样本树用于获得50%最大共有树，即最终的16S rDNA系统进化树（Huelsenbeck &Ronquist，2001; Ronquist &Huelsenbeck，2003）。

1.2.4 菌悬液制备

从LB平板上挑取单菌落，接种在LB液体培养基中，30℃ 150 r·min^-1条件下培养3 d后，5 000 r·min^-1 离心10 min收集菌体，用无菌水洗涤3次后，加入无菌水，制备菌悬液，调整菌悬液的终浓度OD_{600 nm}为0.5~0.6，备用。

1.2.5 种子预处理

挑选颗粒饱满、大小均匀的糯高粱种子，加入70%乙醇，处理2 min；倒掉乙醇，加入5%的次氯酸钠，处理5 min；倒掉次氯酸钠，加入70%的乙醇，处理2 min；倒掉70%乙醇，用无菌水冲洗3~5次。

1.2.6 菌悬液浸种

量取100 mL菌悬液，将糯高粱种子浸泡在菌悬液中，用锡纸包裹避光，室温放置6 h，倒掉菌悬液，用无菌水将糯高粱种子清洗3~5次，用无菌的镊子将糯高粱种子平铺在水琼脂（1.4%琼脂）平板上，将平板倒置于28℃培养箱中培养。对照组用等量蒸馏水处理，每个处理选用100颗糯高粱种子，对照组和实验组分别设置3个重复。

1.2.7 结果统计

分别于第3天和第7天统计种子发芽数量，计算发芽势和发芽率（郑庆钟等，2016）。计算公式：

$\text{发芽势}=\frac{\text{发芽初期（第}3\text{天）种子发芽数}}{\text{供试种子数}}\times 100\mathrm{\%}$

$\text{发芽率}=\frac{\text{发芽初期（第}7\text{天）种子发芽数}}{\text{供试种子数}}\times 100\mathrm{\%}$

1.2.8 种子催芽

将糯高粱种子按照1.2.1的方法进行表面消毒处理，将处理好的种子平铺于水琼脂平板上，将水琼脂平板倒置于28℃培养箱中培养48 h。

1.2.9 盆栽实验

将珍珠岩和蛭石按照1∶2的比例混合均匀，装在塑料花盆中，花盆规格：17.5 cm （高度） × 11.5 cm （底径） × 16.5 cm （口径）。将花盆用报纸封口后，121℃下灭菌30 min。挑选发芽的糯高粱种子种在花盆中，每个花盆播种20颗，每个处理10个花盆。

1.2.10 接菌

用1.2.4的方法制备菌悬液，待糯高粱幼苗露出土面，向每个花盆中加入10 mL菌液，对照组加入等量的无菌水。糯高粱生长过程中，根据需要加入改良霍格兰营养液[海博生物，霍格兰营养液（不含硝酸钙），产品编号为HB8870-1，使用时加入NH₄NO₃ 0.92 g·L^-1和CaCl₂ 0.64 g·L^-1]。

1.2.11 取样及指标测定

接菌30 d后，将糯高粱幼苗从基质中取出，用流水将根冲洗干净，用吸水纸将表面的水吸干，测量糯高粱的株高、鲜重等指标。将糯高粱植株用硫酸-双氧水消解，用凯氏定氮法测定植物全氮含量（马宗琪等，2014），用钼锑抗比色法测定植物全磷含量。采用碱解扩散法测定土壤碱解氮（速效氮）含量（杨清华，2018）；用碳酸氢钠溶液浸提，用钼锑抗比色法测定土壤有效磷含量。

1.3 数据处理

利用Origin 2019软件，对所得数据进行统计分析和作图。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离和鉴定

从糯高粱叶片中分离得到4株细菌，分别编号为HY1-1、HY1-2、HY1-3和HY1-4。如图1：A所示，HY1-1在LB平板上生长良好，菌落呈圆形，黄色，不透明，表面光滑，易挑起；如图1：B所示，HY1-2在LB平板上生长旺盛，菌落较大，略带微红色，表面光滑，不透明，易挑起；如图1：C所示，HY1-3为淡黄色，表面光滑，不透明，易挑起；如图1：D所示，HY1-4为白色针状菌落，表明光滑，不透明，易挑起。

基于菌株的16S rDNA序列构建系统发育树，确定菌株的分类学地位。如图2所示，基于贝叶斯推断树，HY1-1、HY1-2、HY1-3和HY1-4与Bacillus subtilis strain DSM 10聚成一类，置信度为98%，表明这4株菌都属于枯草芽孢杆菌。因此，分别将这4株菌命名为Bacillus subtilis HY1-1、Bacillus subtilis HY1-2、Bacillus subtilis HY1-3和Bacillus subtilis HY1-4。

2.2 植物生长激素IAA的产生能力

称取17.50 mg分析纯IAA标准品，用少量乙醇溶解后，加入约90 mL蒸馏水，将溶液转移到容量瓶中，定容至100 mL，制备浓度为1 mmol·L^-1的IAA标准液。以吸光值为横坐标，以IAA浓度为纵坐标，绘制IAA浓度标准曲线。根据标准曲线计算上清液中IAA的含量，并计算菌液浓度OD_{600 nm}为1时单位浓度菌株IAA的产生量。如表1所示，单位浓度菌株IAA产生量最高的菌株为HY1-1，为2.56 mol·L^-1；其次为HY1-3，单位浓度菌株IAA产生量为2.29 mol·L^-1；单位浓度菌株IAA产生量最低的是HY1-2，为1.43 mol·L^-1。

2.3 菌株对糯高粱种子萌发的影响

如图3： A所示，对照组糯高粱发芽势为17.67%，用HY1-1菌悬液对糯高粱种子进行处理后，发芽势为37.33%，显著提高了111.26%；用HY1-2菌悬液处理后，糯高粱种子发芽势为18.33%，没有显著变化；用HY1-3菌悬液处理后，糯高粱种子发芽势为21.33%，显著增加了7.64%；用HY1-4菌悬液处理后，糯高粱种子发芽势为16.00%，显著降低了5.88%。如图3：B所示，对照组的糯高粱种子发芽率为18.33%，用HY1-1菌悬液处理后，糯高粱种子的发芽率为48.67%，显著提高了165.52%；用HY1-2菌悬液处理后，糯高粱种子发芽率为37.67%，显著提高了105.51%；用HY1-3菌悬液处理后，糯高粱种子的发芽率为41.33%，显著提高了125.48%；用HY1-4菌悬液处理后，糯高粱种子的发芽率为25.67%，显著提高了40.04%。以上表明，4株细菌（HY1-1、HY1-2、HY1-3、HY1-4）对糯高粱种子萌发都有促进作用，其中HY1-1的促进效果最显著。

2.4 菌株对糯高粱生长的影响

综合上述结果，选取HY1-1做盆栽实验。如图4：A所示，与不接菌的对照组相比，接种HY1-130 d后，糯高粱幼苗植株生长旺盛，茎秆健壮。分别从对照组和实验组糯高粱幼苗中随机选取30株测量幼苗的株高，如图4：B所示，对照组幼苗的平均株高为15.53 cm，实验组幼苗的平均株高为20.06 cm。与对照组相比，实验组幼苗的株高显著增加了29.17%（P＜0.05）。这表明菌株HY1-1对糯高粱幼苗的生长有促进作用。

2.5 接种HY1-1对植物-基质体系营养元素的影响

2.5.1 植株全氮和基质速效氮

如图5：A所示，对照组糯高粱植株的全氮含量为24.50 g·kg^-1，接种HY1-1糯高粱植株的全氮含量为24.60 g·kg^-1，两者无显著性差异。如图5：B所示，对照组糯高粱根际基质中速效氮的含量为20.80 mg·kg^-1，接种HY1-1糯高粱根际基质中速效氮的含量为27.40 mg·kg^-1，与对照组相比，实验组基质中速效氮含量增加了31.70%（P＜0.05）。这表明接种HY1-1虽然增加了糯高粱根际基质中速效氮的含量，但没有影响高粱植株对氮素的吸收。

2.5.2 植株全磷和基质有效磷

如图6：A所示，对照组糯高粱植株的全磷含量为3.89 g·kg^-1，接种HY1-1糯高粱植株的全磷含量为4.10 g·kg^-1，与对照组相比，实验组糯高粱植株全磷含量增加了5.12%（P ＜ 0.05）。如图6：B所示，对照组糯高粱根际基质中有效磷的含量为10.77 mg·kg^-1，接种HY1-1糯高粱根际基质中有效磷的含量为13.88 mg·kg^-1，与对照组相比，实验组基质中有效磷增加了28.88%（P＜0.05）。这表明接种HY1-1既增加基质中有效磷的含量，又促进了糯高粱植株对磷元素的吸收。

3 讨论与结论

芽孢杆菌科是一类好氧性产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，其生理特征丰富多样，分布广泛，极易分离培养，是植物内生菌里研究最多以及应用价值广泛的一大类细菌（龚国利等，2020）。本研究从糯高粱叶片中筛选获得的4株内生菌均为枯草芽孢杆菌，这4株均具有植物生长激素IAA产生能力，能够提高糯高粱种子的发芽率，其中HY1-1显著增加了糯高粱幼苗的株高，促进了糯高粱生长。类似的，将枯草芽孢杆菌EA-CB0575接种到土豆根部，土豆干重提高了34.60%。但是，在EA-CB0575的基因组上，由于具有合成吲哚乙酸、铁载体、固氮酶的基因，这些基因在枯草芽孢杆菌中具有一定的保守性（Nicolás et al.，2020），因此枯草芽孢杆菌能够通过溶磷、增强氮固定、产生铁载体的方式直接促进植物生长。李乐等（2016）研究表明根瘤菌剂、TBK复合微生物原菌剂、微生物复合菌剂能显著促进绿豆生长。其中，芽孢杆菌具有抑制植物病原菌、促进植物生长的能力（Alou et al.，2015; Kotb，2015）。吴玉洪等（2023）通过研究海洋贝莱斯芽孢杆菌对黄瓜幼苗促生作用，发现海洋贝莱斯芽孢杆菌具有较高的固氮、产ACC脱氨酶、吲哚乙酸和铁载体能力，对幼苗有很好的促生长作用。张荣胜等（2018）通过研究解淀粉芽孢杆菌对水稻的促生长作用及其机理，发现此菌可产高水平的生长素、赤霉素、脱落酸和亚精胺，不仅对水稻生长有促进作用，而且具有很好的生防效果。刘鲁峰等（2020）从甘蔗中分离得到内生枯草芽孢杆菌，通过浸泡接种玉米种子与甘蔗单芽茎，发现玉米和甘蔗的各项生理指标均优于未接种处理，表明此菌强效的促生长性能。本研究以糯高粱为材料，基于种子萌发、IAA产生量和基质体系营养元素等指标分析，发现枯草芽孢杆菌对糯高粱有很好的促生长性能。本研究与前人的研究相比，不仅扩展了芽孢杆菌的促植物生长寄主范围，而且证明了枯草芽孢杆菌在酿酒原料种植方面的应用价值和潜在前景，为白酒酿造原料的可持续发展提供了菌株资源和技术线索。

虽然本研究未对菌株的溶磷能力和固氮能力进行检测，但盆栽实验表明，在接种HY1-1的糯高粱根际基质中速效氮（碱解氮）含量增加了31.70%，有效磷的含量显著增加了28.88%，间接表明HY1-1具有溶磷和固氮能力，进而提高了寄主植物对磷元素和氮元素的吸收能力。植物内生菌固氮、溶磷能力可为植物生长提供氮素和磷素，进而促进植物生长。在糯高粱生长过程中，需要大量的氮肥和磷肥，而土壤往往满足不了（秦耀祖和尹统利，1980）。氮素和磷素除了会对高粱的产量产生影响以外，还会影响高粱籽粒中总淀粉和支链淀粉的含量（曹昌林等，2011）。此外，低磷胁迫下，高粱的干重、植株地上部分、叶绿素含量和可溶性蛋白的含量都会下降（马建华等，2013）。本文以糯高粱叶为分离源进行研究，结果表明从中获得的枯草芽孢杆菌可为寄主植物提供有效的氮素和磷素营养，既保障了植株的正常生长发育，又为进一步开发糯高粱促生菌株提供了一条有效的筛选途径。此外，在今后的研究中，可将高通量测序和菌株纯培养分离手段相结合，以揭示糯高粱内生菌的多样性及群落组成，筛选获得具有多重促生特性的优良菌株，为选育糯高粱专用菌剂储备菌种资源。基于对菌株HY1-1的初步探索，我们认为在今后的研究中，可以深入挖掘糯高粱响应Bacillus subtilis HY1-1侵染的应答机制，以揭示此菌促进糯高粱生长的深层机理，为提高糯高粱产量和质量提供技术线索和菌种支持。

本研究得到以下3个方面的结论：（1）糯高粱叶片是获得促生长内生菌的重要分离源；（2）从糯高粱叶片中分离筛选的4株枯草芽孢杆菌具备产IAA的能力（1.43~2.56 mol·L^-1），对糯高粱种子萌发具有显著的促进作用，主要表现在可提高种子的发芽势和发芽率；（3）在4株待测菌株中，HY1-1促生长能力最强，可使糯高粱的株高显著提高29.17%、根际基质速效氮含量显著增加31.70%、有效磷含量显著增加28.88%、全磷含量显著增加5.12%，这将为大规模开发促生长菌剂提供了菌种资源。

参考文献