摘要
为提高钝叶酢浆草杂交育种的效率，该研究以6个钝叶酢浆草品种花粉为实验材料，采用离体萌发法，通过正交试验筛选适宜花粉萌发的培养条件；采用TTC染色法、醋酸洋红染色法、I2-KI染色法和亚历山大染色法测定花粉活力，与离体萌发法测定结果进行对比，评估各染色方法的可靠性；在常温（28 ℃）、4、-20、-80 ℃温度分别贮藏花粉0、1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、60 d，检测不同温度对花粉活力的影响，确定最佳的花粉贮藏温度。结果表明：（1）钝叶酢浆草花粉离体萌发的最适培养条件为20 g·L-1琼脂+100 g·L-1蔗糖+200 mg·L-1硼酸+200 mg·L-1氯化钙，温度25 ℃，时间4 h。（2）离体萌发法能够有效测定钝叶酢浆草花粉活力，各染色方法与之对比发现，TTC染色法不能使花粉染色，I2-KI染色法和醋酸洋红染色法测定结果显著高于离体萌发法，亚历山大染色法测定结果与离体萌发法无显著性差异，可以快速、准确地测定花粉活力。（3）在不同温度下钝叶酢浆草花粉活力下降的速度为常温>4 ℃>-20 ℃>-80 ℃，最佳贮藏温度为-80 ℃。该研究结果为钝叶酢浆草人工授粉、杂交育种及花粉收集贮藏提供了理论依据，为解决花期不遇、异地授粉等问题提供了解决方案。
Abstract
To improve the hybrid-breeding efficiency in Oxalis obtusa, this study identified the culture conditions for optimal germination of O. obtusa pollen in vitro, established an efficient pollen vitality staining method, and investigated optimal pollen storage temperature for six cultivars. An orthogonal experiment was used to screen the culture conditions suitable for pollen germination. Different pollen viability staining methods including TTC staining, aceto-carmine staining, I2-KI staining, and Alexander staining, were carried out and results were compared with those of the in vitro germination assay to evaluate their reliability. To determine the effects of temperatures on pollen vitality and an optimal pollen storage temperature, the pollens stored at different temperatures (28, 4, -20, -80 ℃) for different periods (0, 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60 d) were assayed. The results were as follows: (1) The optimal culture condition for the in vitro germination of O. obtusa pollens was 20 g·L-1 agar+100 g·L-1 sucrose+200 mg·L-1 H3BO3+200 mg·L-1 CaCl2, at 25 ℃ for 4 h. (2) The in vitro germination method significantly affected the pollen vitality of O. obtusa. It was found that the pollen vitality ratio determined by I2-KI staining or aceto-carmine staining was significantly higher than that determined by in vitro germination method. The TTC staining did not work on O. obtusa. The Alexander staining revealed a pollen vitality ratio that had no significant difference from that by the in vitro germination method. (3) The descending speed order of the O. obtusa pollen viability at different temperatures was room temperature (28 ℃) > 4 ℃ > -20 ℃ > -80 ℃, and the optimal storage temperature was -80 ℃. To summarize, this study systematically studied the optimal culture conditions for the in vitro germination of O. obtusa pollens and determined that the Alexander method is the most efficient and accurate staining method for pollen viability. This research results provide important theoretical basis for improing artificial pollination, hybrid breeding, pollen collection and pollen storage of O. obtusa, which can potentially solve the problems of missing flowering period and long-distance pollination.
钝叶酢浆草（Oxalis obtusa）简称“OB酢”，是酢浆草科（Oxalidaceae）酢浆草属（Oxalis）植物，是秋植酢浆草类中品种资源最为丰富的一种（许巧贤等，2021），广泛分布于非洲纳米比亚等地区（李娜等，2022）。与大多数原产于南非的物种一样，钝叶酢浆草也是在秋季种植，冬、春季节生长开花，夏季休眠。其花期长达半年的时间，最早可在12月开花，盛花期为2—4月，4月底至5月逐渐休眠；它的花期相对较晚，冬季至初春才会陆续绽放，被归类为晚花类（唐小云等，2023）。钝叶酢浆草掌状复叶由3片心形小叶组成，花单生，多为粉色、砖红色、橙色、黄色或白色，几乎涵盖了所有暖色系，在不同的温度和温差下，花色会有所变化。钝叶酢浆草品种繁多，花色丰富，植株小巧紧凑，花量大，具有较高的观赏价值，适合盆栽和地被种植，具有较大的园艺开发价值（许巧贤等，2021）。钝叶酢浆草的自然结实率较低，多以种球繁殖为主，开发其园艺价值必须通过杂交育种进行品种创新。但是，钝叶酢浆草为异型花柱，并且部分品种存在生殖隔离(Krejcˇíková et al., 2013)，还有花期不遇等问题，造成了钝叶酢浆草杂交育种工作存在一定的困难。
花粉作为遗传物质的载体（刘帅和彭方仁，2023），包含父本所有的遗传信息且具有较强的遗传保守性（刘帅和彭方仁，2023；张琪等，2024），其活力的高低直接影响到杂交育种的结果（俞芹等，2018）。钝叶酢浆草是典型的三型花柱植物，包括长花柱型、中花柱型和短花柱型3种类型，存在上、下两轮雄蕊(Marco & Arroyo, 1998)。不同花柱类型的植株，其花粉活力存在差异；同一种/品种上、下两轮的花粉活力也存在差异（宋费玲等，2021）。因此，检测其花粉活力对提高钝叶酢浆草杂交育种的效率十分必要。钝叶酢浆草还存在花期不遇、异地授粉等问题，因此低温贮藏是保存花粉活力的常见方法，以延长花粉寿命，为杂交育种解决时空限制问题（肖玉菲等，2021）。由此可见，研究钝叶酢浆草花粉的最佳贮藏温度对其杂交育种工作十分重要。
目前，关于酢浆草属花粉的研究大多集中在花粉形态学方面，杨德奎和吴晓霞（2004）、陈明林等（2007）均对酢浆草属花粉形态特征进行观察，Lopez和Rosenfeldt(2016)对南美洲特有的13种酢浆草进行花粉形态研究，陈生煜等（2024）对14种酢浆草属植物花粉形态及表面纹饰进行观测，这些研究为酢浆草的分类学研究提供了一定基础，但在花粉生理学方面的研究相对匮乏。贾文庆等（2010）利用离体培养法筛选出了最适合红花酢浆草（Oxalis corymbosa）花粉萌发的培养基；Tsai等（2010）使用荧光变色反应来测定台湾红花酢浆草的花粉活力，发现其活力非常低；宋费玲等（2021）采用I2-KI法和TTC法测定6个品种的酢浆草属植物花粉的活力，发现TTC染色液对花粉的染色效果不明显，这些初步发现未能形成系统结论。关于钝叶酢浆草花粉的研究几乎处于空白阶段，其离体萌发的最适培养条件尚未知，能快速、准确测定其活力的方法尚不明确，也未见其关于贮藏的研究，严重阻碍了育种工作的展开。
本研究以6个钝叶酢浆草品种的花粉为实验材料，这6个品种均花量大，花期长，花喉大，适合取粉。通过L25(53)正交试验筛选出钝叶酢浆草花粉离体萌发的最佳培养条件；使用TTC染色法、I2-KI染色法、醋酸洋红染色法和亚历山大染色法检测花粉活力，并与离体萌发法测定结果进行对比分析；分别检测在常温（28 ℃）、4、-20、-80 ℃贮藏温度下的花粉活力。本研究拟探讨以下问题：（1）钝叶酢浆草花粉离体萌发的最佳培养条件及不同因素如何影响其萌发率；（2）能够高效、准确测定钝叶酢浆草的花粉活力的染色方法；（3）钝叶酢浆草的最佳贮藏温度。本研究旨在提高测定钝叶酢浆草花粉活力的效率及杂交育种效率，解决花期不遇、异地授粉等问题，为钝叶酢浆草的育种工作提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
选择浙江省东阳市玉米研究所酢浆草属植物种质资源圃的6个钝叶酢浆草品种（表1），于2023年2—3月正值钝叶酢浆草花期时，选择长势良好且无病虫害、开花旺盛的植株，用镊子摘取当天开放的花朵，用小刷子将上、下轮花粉分别收集到硫酸纸上，再倒入2 mL离心管中备用。
表
1
实验材料
Table
1
Experimental materials
1.2 试验方法
1.2.1 最佳培养基配方的筛选
前期预实验结果表明，在只含有不同浓度的蔗糖、硼酸或氯化钙的固体培养基中，蔗糖、硼酸、氯化钙的最适浓度分别为150 g·L-1、200 mg·L-1、200 mg·L-1。为探究蔗糖、硼酸、氯化钙及其交互作用对花粉萌发的影响，在此基础上进行3因素5水平（表2）共25组合的L25(53)正交试验。以‘面纱’花粉为实验材料，取上、下轮花粉备用。用小刷子将花粉均匀散落于凹玻片凹处的培养基表面，将凹玻片置于装有湿滤纸的培养皿中，在25 ℃人工气候箱中恒温培养4 h后，利用光学生物显微镜观察花粉的萌发情况，以花粉管长度大于花粉粒直径的情况视为萌发(Dafni & Firmage, 2000)，并计算花粉萌发率，花粉萌发率（%）=已萌发的花粉数/统计花粉粒总数×100（胡适宜，1993）。每个处理设置3个重复，每个重复观察5个视野，每个视野至少统计50粒花粉。
表
2
正交试验因素水平L25(53)
Table
2
Orthogonal test design factors and levels L25(53)
1.2.2 最适培养条件的筛选
以‘面纱’花粉为实验材料，将培养基分别置于20、25、30、35 ℃这4个温度条件下培养4 h，计算萌发率，确定钝叶酢浆草花粉萌发的最适培养温度。在最适培养温度下分别培养花粉1、2、3、4、5、6 h，确定最适的培养时间。
1.2.3 花粉染色与花粉离体萌发
以‘面纱’（短花柱）、‘极光’（中花柱）、‘红心皇后’（长花柱）的花粉为实验材料，基于代谢活性、内含物和细胞完整性等不同判断标准，采用TTC染色法（江鸣涛，2016）、醋酸洋红染色法（付强等，2020）、I2-KI染色法（张超仪，2012）和亚历山大染色法（王士泉，2020）共4种染色方法来测定花粉活力。
同时，采用1.2.1和1.2.2获得的最佳培养基和最适培养条件进行花粉离体培养，将得到的花粉萌发结果与花粉染色结果进行比较。
1.2.4 花粉低温贮藏
以‘蜡笔’（短花柱）、‘阳光’（中花柱）、‘甜心’（长花柱）的花粉为实验材料。将新鲜花粉装入2 mL离心管中，每管花粉量为1/10离心管体积，在室内通风使花粉自然阴干。干燥后将花粉分别放在常温（28 ℃）、4、-20、-80 ℃ 4种温度下贮藏。为更好体现花粉活力下降的趋势及长期贮藏的稳定性，分别在贮藏0、1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、60 d时，取出花粉进行离体培养，计算萌发率，其中-20 ℃贮藏的花粉用自来水冲洗解冻，-80 ℃贮藏的花粉用37 ℃水浴解冻。
2 结果与分析
2.1 钝叶酢浆草花粉活力培养条件的筛选
2.1.1 最佳培养基配方的筛选
蔗糖、硼酸、氯化钙L25(53)正交试验结果表明，各处理对‘面纱’上、下轮花粉的影响存在一定差异。其中，14号处理的上、下两轮花粉的萌发率均显著高于其他处理，分别为30.78%和27.62%；8号处理和19号处理的花粉萌发率也较高且花粉萌发率相同，上轮花粉萌发率为25.65%，下轮花粉萌发率为24.75%（表3）。这表明蔗糖、硼酸和氯化钙的协同作用可能对花粉萌发具有重要影响。
表
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钝叶酢浆草‘面纱’花粉正交试验的萌发率
Table
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Germination rate of Oxalis obtusa ‘Veil’ pollen in orthogonal design experiment
采用极差分析量化蔗糖、硼酸和氯化钙对‘面纱’花粉萌发率的影响，其中极差K值越大表明该因素影响程度越高。由表4可知，蔗糖在K3水平（蔗糖浓度为100 g·L-1）时对‘面纱’上、下轮花粉萌发率的影响最大，硼酸和氯化钙在K4水平（浓度均为200 mg·L-1）时对其花粉萌发率影响最大。极差R值能够体现各因素对实验结果的作用程度，R值越大表明影响程度越显著。其中，实验3因素对‘面纱’上、下轮花粉萌发率的影响具有一致性，对其影响程度关系为蔗糖>氯化钙>硼酸。
表
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不同因素对钝叶酢浆草‘面纱’花粉萌发影响的极差分析
Table
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Range analysis on effects of different factors on pollen germination of Oxalis obtusa ‘Veil’
在极差分析基础上进行方差分析，进一步明确各因子的显著性。蔗糖浓度对钝叶酢浆草‘面纱’上、下轮花粉萌发率均产生极显著影响，氯化钙影响显著，而硼酸影响不显著（表5）。根据F值排序，影响程度从强到弱依次为蔗糖、氯化钙、硼酸，与极差分析结果一致。
表
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不同因素对钝叶酢浆草‘面纱’花粉萌发影响的方差分析
Table
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Variance analysis on effects of different factors on pollen germination of Oxalis obtusa ‘Veil’
2.1.2 最适培养条件的筛选
不同培养温度和时间对‘面纱’花粉萌发的影响存在显著性差异。当温度为25 ℃时，‘面纱’上、下轮花粉的萌发率均达到最大值，分别为26.09%和22.07%，显著高于其他3种温度处理（图1：A）。温度过高或过低均会抑制花粉的生理活性，影响其萌发能力。从培养时间来看，培养时间过短花粉不能完全萌发，过长则易导致花粉管衰老或破裂。对于上轮花粉而言，培养3、4、5 h时花粉萌发率显著高于其他时间处理，其中4 h显著高于5 h，二者与3 h之间差异不显著；对于下轮花粉而言，花粉萌发率在培养3、4、5 h时显著高于1 h（图1：B）。这说明‘面纱’花粉最佳离体萌发时间为4 h。
图
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不同培养条件对钝叶酢浆草‘面纱’花粉萌发的影响
Fig.
1
Effects of different culture conditions on in vitro pollen germination of Oxalis obtusa ‘Veil’
2.2 钝叶酢浆草花粉染色法与离体萌发法
由图2：A-D可知，除TTC染色法以外，其余3种染色方法均能使钝叶酢浆草花粉着色，并且染色后能够明显区分有活力花粉和无活力花粉。由图2：E可知，离体萌发法能够直接准确观察到花粉管是否萌发、生长，从而有效判断花粉的活力状态。
图
2
5 种方法测定的花粉活力
Fig.
2
Pollen viability tested by five methods
将‘面纱’‘极光’和‘红心皇后’上、下轮花粉的3种染色结果与离体萌发培养结果进行比较，发现4种方法的测定结果存在差异，并且每个方法测定的结果均显示上轮花粉活力略高于下轮花粉活力（表6）。醋酸洋红染色法和I2-KI染色法测定的花粉活力显著高于离体培养法的花粉萌发率，说明醋酸洋红和I2-KI不能很好区分有活力花粉和无活力花粉，均把部分无活力花粉染色。亚历山大染色法除‘极光’下轮花粉以外，其余染色结果均与离体萌发结果差异不显著，略高于离体萌发法。
表
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4种方法测得的3个钝叶酢浆草品种花粉活力比较
Table
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Pollen viability comparison of three Oxalis obtusa varieties tested by four methods
2.3 不同贮藏条件下钝叶酢浆草花粉活力
随着贮藏时间的延长，‘甜心’‘阳光’和‘蜡笔’的花粉活力均逐渐下降。不同温度下花粉活力大体呈此趋势，即-80 ℃>-20 ℃>4 ℃>常温，表明高温会加速花粉代谢使其快速失去活性，低温能抑制代谢延缓活力衰退。在常温贮藏条件下，‘甜心’‘阳光’和‘蜡笔’的花粉活力均在0~10 d内快速下降，于20 d或30 d内失去活性，表明在自然环境下，花粉的寿命为20 d或30 d；在4 ℃贮藏条件下，花粉活力下降显著，在5 d内花粉活力下降迅速，于60 d内完全失去活性；在-80 ℃和-20 ℃的贮藏条件下，贮藏60 d时花粉均具有活性（图3-图8）。在-20 ℃条件下，‘甜心’花粉活力在5 d内下降最快，5~40 d趋于稳定，又在40 d后下降加快（图3、图4）；‘阳光’花粉活力在1~5 d呈上升趋势（图5、图6），可能是由于后熟作用或是抗逆机制的原因；‘蜡笔’花粉活力大体呈匀速下降的趋势（图7、图8）。在-80 ℃条件下，花粉活力总体趋于稳定，呈缓慢下降的趋势，贮藏60 d时‘甜心’‘阳光’和‘蜡笔’的花粉活力均最高，大于其他3个贮藏条件。
图
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‘甜心’上轮花粉贮藏效果
Fig.
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Storage effects of upper pollen of Oxalis obtusa ‘Honey’
图
4
‘甜心’下轮花粉贮藏效果
Fig.
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Storage effects of lower pollen of Oxalis obtusa ‘Honey’
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‘阳光’上轮花粉贮藏效果
Fig.
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Storage effects of upper pollen of Oxalis obtusa ‘Sunshine’
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‘阳光’下轮花粉贮藏效果
Fig.
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Storage effects of lower pollen of Oxalis obtusa ‘Sunshine’
图
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‘蜡笔’上轮花粉贮藏效果
Fig.
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Storage effects of upper pollen of Oxalis obtusa ‘Crayon’
图
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‘蜡笔’下轮花粉贮藏效果
Fig.
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Storage effects of lower pollen of Oxalis obtusa ‘Crayon’
3 讨论与结论
花粉活力是指花粉细胞具有正常发育、生长及完成授粉过程的能力，其受遗传因素与外界环境共同调节。目前，花粉活力测定方法主要包括染色法和离体萌发法。染色法操作简便、快速，其结果可反映出花粉的营养含量或代谢状况，与花粉自身特性（如酶活性、发育状态、花粉壁厚度等）密切相关。相比之下，离体萌发法虽然操作复杂、耗时长，但能够真实反映花粉萌发的情况，测定的数据科学可靠，适用于大多数植物花粉活力的测定（刘帮龙等，2011）。因此，选择合适的花粉活力测定方法对于研究结果的准确性至关重要。
在花粉离体培养萌发的实验中，糖类物质、硼酸和钙对花粉萌发具有重要作用（裘建宇，2012；宋杰等，2018）。本研究正交试验结果表明，蔗糖对‘面纱’花粉萌发率的影响最显著，这一现象在南酸枣（Choerospondias axillaris）（张薇等，2024）、陆川油茶（Camellia vietnamensis）（肖玉菲等，2021）、辣木（Moringa oleifera）（普天磊等，2022）等植物中也有出现。蔗糖不仅能为花粉萌发提供能量支持（龚双姣等，2012），还能调节渗透压，防止花粉过度吸水而破裂或失水造成质壁分离（贾文庆等，2010）。因此，对大部分植物花粉而言，蔗糖是离体培养基中最关键的碳源。硼酸能够促进糖分的吸收与代谢，引导胞外Ca2+进入细胞，参与果胶物质的合成，是促进花粉萌发的关键物质（蔡昭艳等，2021）。钙能够调控花粉管极性生长，显著影响花粉萌发和生长（刘洁云等，2021）。徐斌等（2015）研究发现，随着Ca2+浓度的增加，杜鹃红山茶（Camellia azalea）花粉萌发率逐渐下降，在无氯化钙培养基中萌发率最高，可能是因为其花粉内Ca2+浓度较高，花粉萌发时不需要外源Ca2+来促进萌发；而在本研究中，‘面纱’花粉在200 mg·L-1氯化钙浓度下萌发效果最佳，表明其花粉内Ca2+含量较低，需从外界环境中摄取Ca2+，以促进花粉管的极性生长。
在染色法测定花粉活力的实验中，TTC染色法未能使钝叶酢浆草花粉着色，类似现象在花生（Arachis hypogaea）（王金花等，2022）、风铃木（Handroanthus spp.）（张捷等，2024）、连翘（Forsythia suspensa）（杨延红等，2021）等的花粉研究中也出现过，这可能与其花粉细胞壁阻碍染液渗透、代谢活性较低或呼吸产生的脱氢酶含量不足有关，具体原因有待研究。I2-KI染色法依据花粉内淀粉的含量来判断花粉活力，适合大叶相思（Acacia auriculiformis）（詹妮和黄烈健，2016）、卵叶海桑（Sonneratia ovata）（任飞艳等，2021）等花粉淀粉含量较高的植物。本研究中，I2-KI染色法测定的花粉活力显著高于离体萌发法，表明钝叶酢浆草花粉的淀粉含量不低，并且无活力花粉中的淀粉并未随细胞衰亡而迅速水解。醋酸洋红染色法的测定结果也显著高于离体萌发法且随着染色时间变长，染成红色的花粉数量增加，很难有效判断花粉活力，这与红花酢浆草的染色效果相似（贾文庆等，2010）。醋酸洋红能与花粉细胞核内的DNA结合而使其显色，一般情况下有活力细胞具有完整细胞核，但已衰亡、退化或机械损伤的花粉粒，其细胞核在短期内可能因并未完全溶解而被染成红色，从而导致了假阳性结果(Lata et al., 2018)。相比之下，亚历山大染色法效果较好，与离体萌发结果最为接近。亚历山大染色法同时检测细胞膜的完整性与质体活性，能较好观察有/无活力花粉。有活力花粉中的细胞质被染成红色、花粉壁被染成绿色，无活力花粉的细胞膜破裂，花粉呈绿色，衰败中的花粉呈红绿叠加的状态。可能是因为这种方法排除了在衰败中损伤的花粉细胞，使得其结果与离体萌发法差异不显著。
本研究进一步揭示了钝叶酢浆草花粉活力的多样性，既存在于品种间，也存在于花内不同轮雄蕊间。本研究选取的6个品种的花粉活力排序为‘甜心’（长花柱）>‘阳光’（中花柱）>‘红心皇后’（长花柱）>‘蜡笔’（短花柱）>‘面纱’（短花柱）>‘极光’（中花柱），这表明花粉活力与花柱类型相关性不大，但由于实验样本量有限，需进一步扩大样本量以验证这一结论。与本研究结果不同的是，宋费玲等（2021）在对6个酢浆草品种进行花粉活力测定时发现，花粉活力从大到小排序为中花柱型>长花柱型>短花柱型，但此研究有关花柱类型的样本同样太少。每个品种上、下轮花粉活力也存在差异且上轮花粉活力普遍高于下轮。这一现象与王佳（2021）在野牡丹（Melastoma candidum）、紫薇（Lagerstroemia indica）和腊肠树（Cassia fistula）这3种具有异型雄蕊的植物中的发现相吻合，即不同组雄蕊花粉成分存在差异，长雄蕊花粉活力普遍高于短雄蕊。这表明在具有多轮雄蕊的植物中，不同位置花药的功能分化可能是一种进化趋势。对于钝叶酢浆草而言，这种现象可能是因为上轮花粉位于花冠筒外部，更容易进行传粉，而下轮花粉位于花冠筒内部，传粉较为困难。就从生理方面而言，这种活力的差异还可能是因为两轮花粉在发育过程中积累的营养物质不同，或表达的基因存在差异，具体原因需进一步研究。
花粉保持活力的时间长短与遗传和环境因素有关，可以通过调节花粉湿度、降低温度等方法来延长花粉寿命（肖玉菲等，2021）。低温贮藏是保持花粉活力的常用方法。本研究表明，钝叶酢浆草花粉贮藏温度越低，花粉活力越高，最佳贮藏温度为-80 ℃，这与思茅松（Pinus kesiya var. langbianensis）（付强等，2021）、陆川油茶（肖玉菲等，2021）的研究结果一致。一般情况下，贮藏温度越低，花粉寿命越长，在超低温（小于-180 ℃）下贮藏，花粉代谢活动几乎没有，可实现花粉长期贮藏（王金花等，2022）。但是，超低温贮藏可能引发不可逆冰晶损伤及复温胁迫，因此钝叶酢浆草花粉是否适合超低温贮藏还需进一步实验。此外，花粉含水量也是影响贮藏效果的重要因素，未来可进一步研究新鲜花粉与干燥花粉在-80 ℃条件下的活力差异。
综上所述，本文通过系统研究首次筛选出了钝叶酢浆草花粉离体萌发的最适培养条件：20 g·L-1琼脂+100 g·L-1蔗糖+200 mg·L-1硼酸+200 mg·L-1氯化钙，温度25 ℃，时间4 h。然而，花粉萌发还与培养基pH、培养湿度、光照等因素有关，后续研究可进一步探讨这些因素的作用。在染色法测定花粉活力方面，TTC染色法、I2-KI染色法和醋酸洋红染色法均不适用于钝叶酢浆草，亚历山大染色法是能高效、准确测定钝叶酢浆草花粉活力的方法，可直接用于父本选择和活力评估等。本研究发现，其最佳贮藏温度为-80 ℃。这使得建立花粉种质资源库成为可能，也为品种创新提供了资源保障。本研究结果为钝叶酢浆草人工授粉、杂交育种及花粉贮藏提供了重要的理论依据，并为解决花期不遇问题提供了有效方案。