摘要
为研究水稻OsACS2基因的结构特征及其在水稻发育中的功能，该研究通过生物信息学方法对OsACS2及其在水稻、拟南芥、玉米、小麦、大麦、番茄和马铃薯中同源蛋白的理化性质、结构和亲缘关系进行分析，对水稻植株用植物激素脱落酸(ABA)及茉莉酸甲酯(MeJA)进行处理，利用real-time PCR分析OsACS2基因在水稻根与叶中的表达水平。结果表明：（1）OsACS2基因在水稻、拟南芥、小麦、番茄、马铃薯、玉米及大麦中共有34个同源基因。（2）OsACS2与玉米、小麦中的同源蛋白具有更近的亲缘关系。（3）OsACS2蛋白及其同源蛋白具有相似的亚细胞定位、含有1个保守的AMP (adenosine monophosphate)结合结构域，具有相似的二级结构及三级结构。（4）OsACS2基因的启动子中有ABA及MeJA响应元件，ABA的处理提高了OsACS2在根中的表达，降低了OsACS2在叶中的表达水平，而MeJA的处理使OsACS2的表达水平在根中降低，但提高了叶中的表达水平。该研究为深入解析OsACS2及其同源基因的生物学功能建立理论基础。
Abstract
To study the structural characteristics and functions of rice OsACS2 gene in rice development, the physicochemical properties, structure, and phylogenetic relationships of OsACS2 and its homologous proteins in rice, Arabidopsis thaliana, maize, wheat, barley, tomato and potato were analyzed using bioinformatics methods. Rice plants were treated with phytohormones abscisic acid (ABA) and methyl jasmonate (MeJA), and the expression levels of OsACS2 gene in rice roots and leaves were analyzed using real-time PCR. The results were as follows: (1) There were a total of 34 OsACS2 homologous genes found in rice, Arabidopsis thaliana, wheat, tomato, potato, maize and barley. (2) OsACS2 showed a closer relationship with its homologs in maize and wheat. (3) OsACS2 protein and its homologs showed similar subcellular localization, contained a conserved AMP (adenosine monophosphate)-binding domain, and had similar secondary and tertiary structures. (4) The promoter of the OsACS2 gene contained ABA and MeJA responsive elements, ABA treatment increased the expression of OsACS2 in roots and decreased its expression level in leaves, MeJA treatment resulted in a decrease in the expression level of OsACS2 in roots, but an increase in leaves. This study establishes a theoretical basis for further understanding the biological functions of OsACS2 and homologous genes.
Keywords
乙酰辅酶A合成酶（acetyl-coenzyme A synthetase, ACS）调控线粒体活性参与植物发育。ACS是一种质体酶（plastidic enzyme）（Behal et al., 2002），参与线粒体中的电子传递链和呼吸链反应（Le & Millar, 2023），是产生关键代谢中间体乙酰辅酶A的几种酶之一（Sofeo et al., 2023）。菠菜中的ACS特异性定位在叶绿体中（Liedvogel & Stumpf, 1982），而拟南芥中的ACS定位于质体（Fu et al., 2020）。ACS在拟南芥和玉米的根系生长（Fu et al., 2020; Zhang et al., 2023）及烟草的花粉管快速生长（Mellema et al., 2002）中具有重要作用。ACS基因在拟南芥发育的角果珠柄里大量表达（Ke et al., 2000），ACS活性的降低阻断了外源性乙酸盐和乙醇与脂肪酸的结合，使基因acs1突变体植株变小而出现晚花表型（Lin & Oliver, 2008）。拟南芥中的BZU1基因编码乙酰辅酶A合成酶ACN1，它介导的乙酸-苹果酸代谢旁路通过调控拟南芥保卫细胞的膨压进而调节植物的抗旱性，BZU1基因的突变使植株叶片的气孔变小，从而使植株的抗旱能力更强（Dong et al., 2018）。在柳树中，ACS的过表达增加乙酰化赖氨酸（lysine acetylation，LysAc）的水平并改善植株的耐旱性（Xia et al., 2024）。ACS基因及其同源蛋白在功能上具有保守性，有研究发现，鸡中的长链酰基辅酶A合成酶（ACSL）（Tian et al., 2021）及半活体营养型真菌希金斯刺盘孢（Colletotrichum higginsianum）中的ChAcs1（Gu et al., 2019）参与了脂质代谢。Jiang等（2023）的研究发现，水稻基因组中有拟南芥ACS的同源基因LOC_Os02g32490，在该项研究中，LOC_Os02g32490基因被命名为OsACS2。但是，水稻OsACS2及同源基因的结构及功能仍不清楚。本研究以OsACS2基因及其同源基因为研究区域，采用生物信息学及real-time PCR的方法，通过对OsACS2及其同源基因之间的亲缘关系、理化性质、蛋白结构及基因表达的分析，拟探讨以下问题：（1）OsACS2及其同源基因有何结构特征；（2）OsACS2基因在水稻中的表达模式有何特点。以期为进一步开展OsACS2基因及其同源基因在植物发育中的功能研究建立理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料及生长条件
本试验供试水稻品种为中花11（ZH11）。为检测ACS2启动子中所含有的MeJA和ABA响应元件对基因表达调控的影响，用茉莉酸甲酯（jasmonic acid methyl ester，MeJA）和脱落酸（abscisic acid，ABA）处理水稻苗。MeJA和ABA母液分别用DMSO配制浓度分别为10 mmol·L-1和5 mmol·L-1。水稻种子经表面消毒并在1/2MS固体培养基上暗培养3 d后，根据已有文献(Islam et al.,2009; Zhang et al., 2024)确定MeJA及ABA的使用浓度。将作为实验组的水稻苗分别转至含有1 μmol L-1MeJA和0.5 μmol·L-1 ABA的1/2MS固体培养基上，将对照组的水稻苗转至含有等体积DMSO的1/2MS固体培养基上，置于28 ℃光照培养箱中，12 h光照，12 h黑暗生长4 d，待培养时间结束后，收集水稻苗的根和叶，并检测其OsACS2基因的表达量。
1.2 水稻RNA提取及逆转录反应
收集生长7 d的水稻幼苗的根和叶，提取RNA进行逆转录合成第一链cDNA（Zhao et al., 2021）。逆转录反应20 μL体系，包括5 μL总RNA、4 μL 5×TransScript® All-in-One SuperMix for qPCR试剂（北京全式金生物技术有限公司）、1 μL gDNA Remover、10 μL RNase-free H2O。逆转录反应条件：25 ℃、10 min后，42 ℃孵育15 min；85 ℃反应5 s。
1.3 Real-time PCR检测OsACS2基因表达
利用real-time PCR方法分析水稻中OsACS2基因的表达量，10 μL反应体系：0.5 μL cDNA、5 μL PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix（Thermo Fisger Scientific公司）、0.4 μL正向引物OsACS2-FP（5′-TAATCCTAGCGCATGGAGAT-3′）和0.4 μL反向引物OsACS2-RP（5′-AACAATGACA GGCTGA ACAC-3′）、3.7 μL dd H2O。反应程序：95 ℃预变性5 min后，95 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，共40个循环。水稻ACTIN7基因（Os11g0163100）为内参基因，所用引物为OsACTIN7-FP（5′-GAGTATG ATGAGTCGGGTCCAG-3′）及OsACTIN7-RP（5′-AC ACCAACAATCCCAAACAGAG-3′）。每个PCR反应的模板cDNA来自3株水稻苗的根或叶中的RNA，每个PCR结果进行3次生物学重复，以2-△△Ct计算基因相对表达量。
1.4 OsACS2及其同源基因的生物信息学分析
基于蛋白质序列的相似性，通过NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）及水稻数据库查找到水稻OsACS2（LOC_Os02g32490）的氨基酸序列，并通过BLAST得到OsACS2在拟南芥、小麦、番茄、马铃薯、玉米、大麦中的同源基因序列。使用Expasy（http://www.expasy.ch/tools）对OsACS2及其同源蛋白进行理化性质分析，采用CELLO v.2.5（http://cello.life.nctu.edu.tw/）进行亚细胞定位分析，通过DNAMAN软件及在线网站Multiple Sequence Alignment by CLUSTALW进行同源序列比对，利用在线网站ESPript3.0提取保守结构域进行分析，利用MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）进行基序分析，运用MEGA11软件的ClusX功能进行同源序列比对，采用最大似然法构建系统发育树。使用SOMPA（https://npsa.lyon.inserm.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）进行蛋白质二级结构分析（杨改霞等，2024），使用UniProt（https://www.uniProt.org/uniprotkb/A3CCD5）进行蛋白质三级结构分析（罗静初，2019）。利用PlantCARE（Lescot et al., 2002）（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析OsACS2及其同源基因的启动子在2 000 bp内的顺式响应元件，并使用TBtools（Chen et al., 2023）软件作图。
2 结果与分析
2.1 OsACS2及其同源基因的序列比对及蛋白质理化性质分析
以水稻OsACS2基因编码的氨基酸序列作为参考序列，在国家水稻数据库（https://www.ricedata.cn/gene/）及NCBI上分析后，得到了OsACS2在水稻、拟南芥、小麦、番茄、马铃薯、玉米及大麦中的34个同源基因（表1）。其中，水稻中有6个同源基因，拟南芥中有6个同源基因，小麦中有7个同源基因，番茄中有3个同源基因，马铃薯中有1个同源基因，玉米中有8个同源基因，大麦中有3个同源基因。水稻中的KAF2945083.1与OsACS2序列相似性最高，为99.7%；而玉米中的ONM62616.1与OsACS2相似性最低，为41.4%。对水稻OsACS2及其同源蛋白的理化性质进行分析，结果显示OsACS2及其同源蛋白的相对分子量为42 839.11~86 767.90 Da，等电点为5.11~8.16，不稳定指数为20.37~36.28，OsACS2及其同源蛋白均为亲水性蛋白（表2）。
2.2 OsACS2及其同源蛋白的系统发育树分析
为探究OsACS2及其同源蛋白的亲缘关系，进一步构建OsACS2及其在水稻、拟南芥、玉米、小麦、大麦、马铃薯和番茄中OsACS2同源蛋白的系统发育树。结果显示，OsACS2与水稻中的同源蛋白KAF2945083.1在同一小群，与玉米和小麦中的同源蛋白NP_001354298.1、AQK71376.1、XP_04415492.1、XP_044405044.1、XP_044421689.1及XP_044950727.1在一个大群中（图1）。
2.3 OsACS2及其同源蛋白的亚细胞定位分析
对水稻OsACS2蛋白及其同源蛋白的亚细胞定位进行分析，结果显示水稻OsACS2定位于细胞质的可能性最高。水稻、拟南芥和大麦中的OsACS2同源蛋白定位在细胞质、叶绿体及胞外的可能性较高，定位在细胞骨架和高尔基体的可能性较低；小麦中的OsACS2同源蛋白定位在细胞质、叶绿体和胞外的可能性较高，定位在细胞骨架、高尔基体和细胞核的可能性较低；番茄中的OsACS2同源蛋白定位在胞外、细胞质、质膜及叶绿体的可能性较高，定位在细胞骨架和高尔基体的可能性较低；马铃薯中的OsACS2同源蛋白定位在细胞质的可能性较高，定位在细胞骨架和高尔基体的可能性较低；玉米中的OsACS2同源蛋白定位在胞外、细胞质及溶酶体的可能性较高，定位在细胞骨架和高尔基体的可能性较低(表3)。
表
1
OsACS2及其同源蛋白的序列相似性
Table
1
Sequence identities of OsACS2 and its homologous proteins
表
2
OsACS2及其同源蛋白的理化性质
Table
2
Physicochemical properties of OsACS2 and its homologous proteins
图
1
OsACS2及其同源蛋白的系统发育树
Fig.
1
Phylogenetic tree of OsACS2 and its homologous proteins
2.4 OsACS2及同源蛋白的结构分析
对OsACS2及其同源蛋白的结构域进行分析，发现OsACS2及其同源蛋白具有1个保守的AMP(adenosine monophosphate)-binding结构域（图2）。对OsACS2及同源蛋白的基序（motif）进行分析，发现大部分蛋白含有5个motifs，而水稻同源蛋白中CAE05367.3含有Motif 1、Motif 3、Motif 4和Motif 5，玉米同源蛋白中AQK71376.1含有Motif 1、Motif 2、Motif 4和Motif 5，Onm62616.1含有Motif 2、Motif 3和Motif 5（图3）。对OsACS2及同源蛋白进行结构分析，结果显示，这些二级结构中均含有无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角等结构。其中，无规则卷曲数量占比最高，α-螺旋占比次之，β-转角占比最小（表4）。对水稻、拟南芥、小麦、番茄、马铃薯、玉米、大麦中与OsACS2序列具有最高相似性的同源蛋白的二级结构分析发现，OsACS2及其同源蛋白的二级结构及三级结构在这些植物中具有相似性（图4、图5）。
2.5 OsACS2启动子激素响应元件及基因表达分析
为进一步探究OsACS2在水稻生长中的作用，对OsACS2基因及与其序列相似性最高的同源基因启动子中的激素响应元件进一步分析，发现OsACS2及其同源基因的启动子含有ABA响应元件ABRE以及MeJA响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif（表5、图6）。当水稻用1 μmol·L-1 MeJA和0.5 μmol·L-1 ABA处理后，与DMSO处理的对照相比，ABA处理使根中OsACS2基因表达量极显著上升，而MeJA处理使根中OsACS2基因表达量显著降低；ABA处理使叶中OsACS2基因表达量显著降低，而MeJA处理后使叶中OsACS2基因表达量极显著上升（图7）。
表
3
OsACS2及其同源蛋白的亚细胞定位
Table
3
Subcellular localization of OsACS2 and its homologous proteins
注：*表示亚细胞定位的主要位点。
Note:* indicates the major site of subcellular localization.
图
2
OsACS2及其同源蛋白的结构域
Fig.
2
Domains of OsACS2 and its homologous proteins
图
3
OsACS2及其同源蛋白的基序
Fig.
3
Motifs of OsACS2 and its homologous proteins
表
4
OsACS2及其同源蛋白的二级结构
Table
4
Secondary structures of OsACS2 and its homologous proteins
图
4
OsACS2及其同源蛋白的二级结构
Fig.
4
Secondary structures of OsACS2 and its homologues proteins
3 讨论与结论
线粒体参与的能量代谢在植物生长中具有重要作用。乙酰辅酶A作为线粒体电子传递链和呼吸链反应中的重要成分，其表达与ACS的功能密切相关。本研究发现，水稻的OsACS2及其同源基因在进化及结构上具有保守性，表明OsACS2及其同源基因在植物发育中具有重要作用。但是，OsACS2及其同源基因在不同植物中的多拷贝现象是否与植物中的全基因组复制事件有关还不清楚（Delpozo & Ramirez, 2015; Clark & Donoghue, 2018）。OsACS2与玉米、小麦中的同源蛋白在系统发育树中位于一个大枝，表明OsACS2及其同源蛋白在水稻、玉米及小麦中的功能具有相似性。本研究表明，OsACS2及其同源蛋白具有相似的蛋白结构，但OsACS2同源蛋白参与根系（Fu et al., 2020; Zhang et al., 2023）、花粉管（Mellema et al., 2002）、角果（Ke et al., 2000）及花（Lin & Oliver, 2008）的生长发育，表明OsACS2及其同源蛋白具有功能多样性。OsACS2同源蛋白可定位于叶绿体（Liedvogel & Stumpf, 1982）和质体（Fu et al., 2020），本研究发现OsACS2及其同源蛋白的定位主要在胞外、质膜、细胞质及叶绿体，但许多研究显示OsACS2同源蛋白主要参与调控线粒体活性（Le & Millar, 2023）。这表明OsACS2及其同源蛋白可能在不同细胞器及细胞膜与细胞质间运动，并定位于细胞中的不同位置而调控植物的发育。
图
5
OsACS2及其同源蛋白的三级结构
Fig.
5
Tertiary structures of OsACS2 and its homologous proteins
图
6
OsACS2及其同源基因启动子中的激素响应元件
Fig.
6
Phytohormone response elements in the promoters of OsACS2 and its homologous genes
表
5
OsACS2启动子中的激素响应元件
Table
5
Hormone-related response elements in OsACS2 promoter
图
7
ABA及MeJA处理后水稻苗的OsACS2基因表达水平
Fig.
7
Expression levels of OsACS2 gene in rice seedlings treated with ABA and MeJA
植物激素ABA与抗旱密切相关（Mukherjee et al., 2023），OsACS2同源蛋白通过调控拟南芥中叶片的气孔大小（Dong et al., 2018）和柳树中乙酰化赖氨酸的含量（Xia et al., 2024）参与植株的抗旱性。本研究发现，ABA诱导了水稻根中OsACS2的高表达，但MeJA抑制了根中OsACS2的表达；而ABA抑制了水稻叶中OsACS2的表达，但MeJA诱导了叶中OsACS2的高表达。因此，我们推测水稻的抗旱性可能与ABA诱导根中OsACS2的表达、MeJA诱导叶中ACS2的表达有关，但这还需进一步的实验验证。
本研究发现，OsACS2及其同源蛋白均包含AMP-binding结构域，在许多蛋白中都发现该结构域，并认为其具有重要功能。在根霉中，AMP-binding结构域涉及外源脂肪酸的输入（Brands & Dormann, 2022）；在水稻中，含有AMP-binding结构域的OsAAE3基因负调控稻瘟病抗性、小花发育和木质素生物合成（Liu et al., 2016）；在苹果中，MdLACS2基因含有AMP-binding结构域，通过参与蜡生物合成途径而增强苹果对干旱和盐胁迫的抵抗力（Zhang et al., 2020）。OsACS2及其同源蛋白含有AMP-binding结构域，表明OsACS2及其同源基因在植物的发育、抗病性及非生物胁迫中具有重要作用，这可能与OsACS2及其同源蛋白参与线粒体介导的能量代谢相关，但OsACS2和同源基因在植物发育中的功能及所涉及的信号传导途径还需要深入研究。
本研究还发现，OsACS2及其同源基因在进化上具有高度保守性，细胞定位及蛋白结构分析显示其在功能上具有多样性。ABA及MeJA可调控水稻叶及根中OsACS2的表达，显示OsACS2及其同源基因可能参与植物的生物及非生物胁迫等生长发育过程，这为后续深入研究OsACS2及同源蛋白在水稻等不同作物生长发育中的功能奠定了理论基础，并为利用OsACS2及其同源基因进行作物改良提供了理论依据。