水稻OsNGCD基因家族鉴定与非生物胁迫表达谱分析
doi: 10.11931/guihaia.gxzw202505001
苏晶 ， 钱娇娇 ， 田永丽 ， 张丹婷 ， 罗成科 ， 李培富 ， 马天利
宁夏大学 农学院，宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室，银川 750021
基金项目: 宁夏回族自治区教育厅高等学校科学研究重点项目（NYG2024009）
Identification of OsNGCD gene family in rice and analysis of its expression profiles under abiotic stress
SU Jing ， QIAN Jiaojiao ， TIAN Yongli ， ZHANG Danting ， LUO Chengke ， LI Peifu ， MA Tianli
Key Laboratory of Modern Molecular Breeding for Dominant and Special Crops in Ningxia, College of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan 750021, China
摘要
水稻（Oryza sativa）是全球重要的粮食作物，其产量常因盐、碱、干旱等非生物胁迫而受到严重影响。葡萄糖神经酰胺酶（glucosylceramide enzyme, GCD）作为鞘脂代谢通路的关键酶，在植物非生物胁迫响应中的分子机制尚未阐明，并且目前缺乏系统性的生物信息学研究。该研究采用全基因组分析方法，在水稻中鉴定出 4 个OsNGCD基因家族成员（OsNGCD1-OsNGCD4），通过整合生物信息学分析和实验验证手段，系统解析了该基因家族的分子特征、进化关系及表达调控模式，旨在揭示其在植物非生物逆境胁迫应答中的生物学功能。结果表明：（1）生物信息学分析显示，这些成员均含有保守的 DUF608 结构域，并且其启动子区域富含干旱响应元件（MBS）及激素响应元件（ABRE/GARE）。（2）组织表达谱分析表明，OsNGCD1 优势表达于三叶期的根；OsNGCD2 高表达于萌芽期、根及蜡熟期籽粒中；OsNGCD3 在萌芽期、三叶期的茎和叶及孕穗期花序中表达量均较高；OsNGCD4 在各阶段茎中持续高表达。（3）qRT-PCR 分析进一步揭示，OsNGCD1和OsNGCD4在叶片中受盐、碱和干旱胁迫诱导时，表现出快速且强烈的表达上调，表明它们可能在胁迫初期的快速响应中发挥关键作用。相比之下，OsNGCD2则展现出独特的根系优势表达模式，尤其是在胁迫后期，其在根系中的表达量显著高于叶片。该研究阐明了OsNGCD基因家族通过时空特异性表达模式参与水稻逆境适应的分子机制，为抗逆育种提供了新的靶点。
Abstract
Rice (Oryza sativa) is a globally important food crop, and its yield is often severely affected by abiotic stresses such as salinity and drought. Glucosylceramide enzyme (GCD), as a key enzyme in the sphingolipid metabolic pathway, its molecular mechanism in response to abiotic stress in plants has not been clarified, and there is currently a lack of systematic bioinformatics research. In this study, a genome-wide analysis method was used to identify four OsNGCD gene family members (OsNGCD1-OsNGCD4) in rice. Through the integration of bioinformatics analysis and experimental verification methods, the molecular characteristics, evolutionary relationships, and expression regulation patterns of this gene family were systematically analyzed, aiming to reveal its biological functions in response to abiotic stress in plants. The results were as follows: （1）Bioinformatics analyses revealed that all OsNGCD members contained a conserved DUF608 domain and possessed promoter regions enriched with drought-responsive (MBS) and hormone-responsive (ABRE/GARE) cis-acting elements. （2）Tissue expression profiling analysis indicated that OsNGCD1 was predominantly expressed in roots at the three-leaf stage; OsNGCD2 was highly expressed in roots at the germination stage and in grains at the wax ripening stage; OsNGCD3 had high expression levels in stems and leaves at the three-leaf stage and in inflorescences at the booting stage; OsNGCD4 was continuously highly expressed in stems at all stages. （3）Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) analysis revealed that OsNGCD1 and OsNGCD4 exhibited a rapid and strong upregulation in leaves under salt, alkali, and drought stress conditions, suggesting their potential role in early stress response regulation. In contrast, OsNGCD2 displayed a distinct root-predominant expression pattern, particularly during later stress stages, with significantly higher expression levels in roots compared to leaves. This study elucidates the OsNGCD gene family's molecular mechanisms in rice stress adaptation through spatiotemporal expression patterns, offering novel targets for stress-resistant crop breeding.
水稻（Oryza sativa）作为全球近半数人口的主粮作物，其产量稳定性是世界粮食安全的基石。然而，在极端气候变化背景下，日益频发的盐、碱、干旱等非生物胁迫已成为制约水稻可持续生产的关键环境限制因子。据统计，全球约20%的灌溉耕地正遭受不同程度的盐渍化危害，干旱胁迫导致的作物产量损失在50%以上，并且多种非生物胁迫的复合作用往往会产生协同效应，对作物产量和品质造成更为严重的负面影响（Singh, 2021；Muhammad et al., 2024；Zhao et al., 2024；马唯一等，2025）。因此，发掘关键功能基因和家族，深入解析水稻抗逆分子机制和调控网络，对培育耐逆性新品种具有重要战略意义。
近年来，未知功能结构域（domain of unknown function, DUF）蛋白的功能研究为植物抗逆机制提供了新视角（Luo et al., 2024）。根据Pfam数据库（Pfam 35.0）统计，在19 632个蛋白质家族中，约有24%（4 795个）属于DUF类型（Mistry et al., 2021）。这些结构域通常以“DUF”加数字编号命名，待其功能明确后会被重新分类命名。例如，DUF1和DUF2现已被分别命名为GGDEF和EAL结构域（Schultz et al., 1998；Bateman et al., 2010）。DUF蛋白功能注释的滞后性与其在生命活动中的重要性形成鲜明对比。随着功能基因组学的发展，多个DUF家族基因已被证实参与植物逆境响应。例如：拟南芥ESK1（DUF231家族）是耐寒性的负调控因子（Xin et al., 2007）；水稻OsSIDP366（DUF1644家族）正向调控干旱和盐胁迫抗性（Guo et al., 2016）；拟南芥AtRDUF1（DUF1117家族）正调控盐胁迫响应（Li et al., 2013）；水稻OsDSR2（DUF966家族）负调控盐、干旱胁迫及ABA信号转导（Luo et al.,2014）。
本研究聚焦水稻DUF608家族基因OsNGCD。该家族编码非溶酶体葡萄糖神经酰胺酶（non-lysosomal glucosylceramide enzyme），这类葡萄糖神经酰胺酶（glucosylceramide enzyme, GCD）在鞘脂代谢中发挥关键作用。鞘脂不仅是细胞膜结构组分，更是重要的信号分子，参与调控植物生长发育和逆境响应（Pata et al., 2010；Markham et al., 2013；Bi et al., 2014）。葡萄糖神经酰胺（glucosylceramide，GlcCer）是植物鞘脂类的主要组分之一（Markham et al., 2006）。Msanne等（2015）研究表明，敲除葡萄糖神经酰胺合成酶会导致植物幼苗死亡，这充分说明葡萄糖神经酰胺对植物的生长和发育具有至关重要的作用。模式植物拟南芥中已鉴定出4个葡萄糖神经酰胺酶基因，其中AtGCD3被证实具有特异性水解长酰基链糖基神经酰胺的生化活性（Dai et al., 2020）。尽管葡萄糖神经酰胺酶同源基因在拟南芥等模式植物中的功能已有初步探索，但水稻中该类基因全基因组水平系统鉴定和功能网络分析仍待完善。
基于此，本研究采用生物信息学与分子生物学相结合的策略，在水稻全基因组范围内对OsNGCD基因家族成员进行全面鉴定和分析，内容涵盖基因鉴定与分类、系统进化分析、基因结构解析、染色体定位、启动子区域顺式作用元件分析，以及家族成员在不同组织和多种胁迫条件下的表达水平变化研究。以期为深入探索OsNGCD基因家族的功能及抗逆育种提供重要的理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本研究以粳稻品种日本晴（Oryza sativa L. ssp. Japonica cv. Nipponbare）为试验材料，该材料由本实验室长期保存并繁殖。
1.2 OsNGCD基因家族的鉴定与蛋白质理化性质分析
从RGAP数据库（http://rice.uga.edu）获取候选基因 Os07g0444000 的蛋白质序列信息。基于Ensembl Plants数据库（https://plants.ensembl.org）下载IRGSP-1.0版本的水稻全基因组序列（FASTA格式）和基因组注释文件（GFF3格式）。使用TBtools软件进行BLASTP比对（E-value<1e-5），初步鉴定出4个OsNGCD家族成员。通过Pfam数据库（http://pfam.xfam.org/）对候选蛋白序列进行结构域（PF04685）验证，最终确定OsNGCD家族成员为 Os07g0444000、Os08g0111200、Os10g0473400和Os11g0242100。
采用Expasy-ProtParam工具（https://web.expasy.org/protparam）预测各成员的氨基酸数量、分子量、理论等电点及不稳定系数（Wilkins et al., 1999）。利用Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi）和CELLO（http://cello.life.nctu.edu.tw）预测亚细胞定位（Chou & Sjem, 2008）。蛋白质二级结构和三级结构分别通过SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr）和SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org）在线工具进行预测（Guex et al., 2009；Bienert et al., 2017；Bertoni et al., 2017；Waterhouse et al., 2018）。所有生物信息学分析均基于2025年3月2日至同年4月20日期间下载的数据库版本。
1.3 OsNGCD多序列比对及基因结构分析
使用DNAMAN软件进行OsNGCD蛋白序列多重比对（默认参数）。通过The MEME Suite（https://meme-suite.org）分析保守基序（参数设置：重复次数0~1，最大基序数10），结果以MEME.xml格式输出，并利用TBtools可视化。从NCBI获取Hitdata.txt文件，通过ChiPlot（https://www.chiplot.online）展示保守结构域。基于Ensembl基因组注释文件，采用TBtools的Visualize Gene Structure功能分析基因结构。
1.4 系统发育分析
从NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和Phytozome（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）数据库获取拟南芥葡萄糖神经酰胺酶蛋白序列。使用MEGA-X软件，以邻接法（neighbor-joining）构建系统发育树（参数：ClustalW多重比对，Bootstrap检验500~1 000次）。进化树结果以NWK格式保存，并通过ChiPlot进行可视化优化。
1.5 顺式作用元件分析
基于水稻基因组注释文件，利用TBtools提取OsNGCD家族编码序列（coded sequence，CDS）及其起始密码子上游2 000 bp的启动子区域（Chen et al., 2023）。将启动子序列提交至PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）预测顺式作用元件，筛选与植物激素响应及胁迫相关的元件，并通过TBtools的Simple biosequence viewer可视化。
1.6 表达模式分析
通过RiceXPro数据库（https://ricexpro.dna.affrc.go.jp/）分析OsNGCD家族在不同组织中的表达谱。本研究采集了水稻日本晴不同生长发育阶段的组织样品，包括萌发种子（3 d的胚），幼苗期组织[根、茎、叶（20 d的幼苗）]，营养生长期组织[根、茎、叶（36 d的幼苗）]，生殖生长期组织（花序、灌浆期籽粒、乳熟期籽粒和蜡熟期籽粒）。每个样品均设3个重复，经液氮速冻后于-80 ℃保存。此外，从水稻表达谱数据库RiceXPro中下载了OsNGCD基因在茉莉酸（jasmonic acid，JA）、脱落酸（abscisic acid，ABA）、细胞分裂素（cytokinin，CTK）、赤霉素（gibberellic acid，GA）和生长素（indole-3-acid，IAA）处理30 min后的基因芯片数据，并通过TBtools的HeatMap工具进行可视化。
1.7 非生物胁迫处理
水稻种子经15% NaClO表面消毒后，于温室中萌发（6 d）。幼苗移栽至插板，依次进行：第1天（1 d）蒸馏水培养→第2天（2 d）1/2强度水稻营养液（组分：NH4NO3 114.3 mg·L-1, NaH2PO4·2H2O 50.4 mg·L-1, K2SO4 89.3 mg·L-1, CaCl2 110.8 mg·L-1, MgSO4·7H2O 405 mg·L-1, Na2SiO3·9H2O 568 mg·L-1及微量元素）→后续每日全营养液培养（每2 d换液）。待水稻幼苗在营养液中长至三叶一心后分别进行盐（0.15 mol·L-1 NaCl）（楚乐乐等，2020）、碱（NaHCO3∶Na2CO3=1∶1，0.02 mol·L-1，pH=9.55）（路旭平等，2021）和PEG-6000模拟干旱胁迫处理（15% PEG-6000）（摆小蓉等，2023），以正常营养液培养为对照。分别于处理1、2、3 d采集根和叶片样品（液氮速冻，-80 ℃保存）。每个处理含3个生物学重复，每个重复取3株混合采样。
1.8 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）
采用TRNzol Universal试剂提取总RNA，经反转录试剂盒合成cDNA，保存于-20 ℃。使用Analytik Jena qPCR仪，以2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix为荧光染料。反应体系20 μL。程序：95 ℃ 30 s预变性；95 ℃ 10 s→60 ℃ 30 s，45个循环。OsNGCD家族及内参基因OsActin引物见表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用2-ΔΔCt法计算相对表达量（朱瑞婷等，2021）。
2 结果与分析
2.1 OsNGCD基因家族鉴定及理化性质分析
通过BLASTP同源比对和结构域（PF04685）分析，本研究在水稻基因组中共鉴定出4个OsNGCD家族成员（表2）。系统命名分析显示，这些基因分布于水稻第7号、第8号、第11号和第12号染色体上，根据其染色体定位和结构特征，依次命名为OsNGCD1（Os07g0444000）、OsNGCD2（Os08g0111200）、OsNGCD3（Os10g0473400）和OsNGCD4（Os11g0242100）。
该家族成员编码蛋白的氨基酸长度存在明显差异（463~974 aa），相应分子量范围为52.48~109.27 kDa；等电点分析表明，所有成员的理论等电点（PI）均呈酸性（5.31~6.79）；蛋白质稳定性预测显示，除OsNGCD2（不稳定系数<40）以外，其余成员均为不稳定蛋白（不稳定系数>40）（表2）。
亚细胞定位分析揭示该家族成员具有明显的区室化分布特征，OsNGCD1和OsNGCD2可能定位在过氧化物酶体；OsNGCD3可能定位在叶绿体、细胞质、线粒体和过氧化物酶体；OsNGCD4可能存在细胞质和过氧化物酶体的双重定位。这种差异化的亚细胞定位模式表明，OsNGCD家族成员可能在植物细胞的不同区室中发挥特异性功能。
2.2 OsNGCD蛋白序列分析与结构预测
通过DNAMAN软件对OsNGCD家族蛋白进行多重序列比对，结果（图1）显示，4个成员间具有较高的序列相似性（identity=54.79%），所有 OsNGCD蛋白均含有典型的DUF608结构域，进一步验证了这些基因属于该家族。值得注意的是，在C端区域观察到更高的保守性，表明该区域可能在蛋白功能中发挥重要作用。
OsNGCD蛋白二级结构均由α-螺旋（30.49%~49.24%）、无规则卷曲（>40%，占比最高）和延伸链（<20%，占比最低）组成。所有蛋白均不存在β-折叠结构，这种独特的结构组成模式可能与蛋白的功能特异性相关（表3、图2）。基于SWISS-MODEL的同源建模结果（图3）显示，三级结构预测与二级结构分析结果高度一致，各成员均呈现典型的球状蛋白结构特征。这些结构特征表明，虽然OsNGCD家族成员在序列上存在一定差异，但可能保持着相似的三维结构框架，这为理解其生物学功能提供了结构基础。
2.3 OsNGCD基因家族的基因结构、保守基序和保守结构域分析
通过比较基因组学分析发现，OsNGCD基因家族成员呈现显著的外显子-内含子结构差异，OsNGCD1含有最简单的基因结构（2个外显子）（图4）。OsNGCD2-OsNGCD4的基因结构则相对复杂（17~19个外显子），这种结构分化（exon-intron architecture divergence）可能通过选择性剪接和转录调控元件的差异来影响功能的分化。
OsNGCD基因家族成员的保守基序分析结果（图5）显示，4个成员共分析得到10个motif序列，其中OsNGCD1仅含6个基序（缺失motif 7-motif 10），而OsNGCD2-OsNGCD4完整保留10个预测基序（motif 1-motif 10）。InterProScan分析（图6）显示，所有成员均含功能核心结构域DUF608，OsNGCD2含有特异性结构域COG4354，可能参与原核同源功能，而OsNGCD3-OsNGCD4含有特异性结构域Glyco_hydr_116N可能与糖水解酶活性有关。motif 1-motif 6位于DUF608结构域内，motif 7-motif 10与COG4354、Glyco_hydr_116N结构域共定位。
表 1 OsNGCD家族成员qRT-PCR分析的引物序列
Table 1 Primer sequences for qRT-PCR analysis of OsNGCD family members
表 2 OsNGCD家族成员蛋白理化性质及亚细胞定位分析
Table 2 Physicochemical properties and subcellular localization of OsNGCD family members in rice
2.4 同源蛋白系统进化分析
基于邻接法构建的水稻和拟南芥同源蛋白系统进化树（图7）显示：OsNGCD2单独形成一个进化枝，表现出明显的序列分化，可能获得新功能；OsNGCD4与拟南芥 AT5G49900聚为一簇，提示功能保守性；OsNGCD1/OsNGCD3与 AT3G24180构成单系群。
2.5 OsNGCD基因家族的顺式作用元件分析
通过对OsNGCD基因家族成员启动子区结构域(转录起始位点上游2 kb)的系统分析，我们鉴定出3类功能显著的顺式调控元件，即发育调控元件、植物激素响应元件、胁迫响应元件。(1)在发育调控元件中，分生组织特异性表达元件（CAT-box）存在于OsNGCD1和OsNGCD4的启动子；贮藏蛋白代谢调控元件(O2-site)存在于OsNGCD1/OsNGCD2/OsNGCD4的启动子。(2)在植物激素响应元件中，脱落酸响应元件（ABRE)在所有成员均含有1~2个拷贝；水杨酸响应元件（TCA-element)为OsNGCD2/OsNGCD4特异性存在；赤霉素响应元件（GARE-motif）为OsNGCD3独有；茉莉酸甲酯响应元件(CGTCA-motif)为OsNGCD2/OsNGCD3共有；生长素响应元件（TGA-element）仅存在于OsNGCD1启动子区。(3)在胁迫响应元件中，MYB结合干旱响应元件(MBS)保守存在于 OsNGCD1/OsNGCD3/OsNGCD4；防卫与胁迫响应元件(TC-rich)大多存在于OsNGCD1；厌氧诱导元件(ARE)在全家族广泛分布；缺氧诱导元件(GC-motif)为OsNGCD3独有（图8)。这表明OsNGCD基因家族成员可能广泛参与植物激素和逆境信号的响应。
图 1 OsNGCD 蛋白多重序列比对分析
Fig. 1 Multiple sequence alignment of OsNGCD proteins
表 3 OsNGCD 蛋白二级结构预测
Table 3 Secondary structure prediction of OsNGCD proteins
2.6 OsNGCD基因家族的组织表达谱与激素响应分析
基于RiceXPro数据库不同组织转录组数据的系统分析表明，OsNGCD家族成员呈现显著的组织表达特异性。具体而言，OsNGCD1主要在叶片、根系和雌蕊中表达，而在叶鞘、茎、花序等营养器官中的表达量相对较低；OsNGCD2主要在叶片和根系中表达量较高，而在其他组织中的表达量较低；OsNGCD3主要在茎、雌蕊和胚中表达，而在叶片等其他组织中的表达量较低；OsNGCD4主要在茎、花序和叶片中表达，而在根系、叶鞘、雄蕊、胚和胚乳中的表达量较低（图9：A）。
为进一步了解该家族的潜在生物学功能，本研究通过qRT-PCR系统分析了OsNGCD家族每个成员在水稻不同组织部位的mRNA表达变化。如图9：B所示，OsNGCD1在三叶期的根中呈现优势表达；OsNGCD2在萌芽期、根及蜡熟期籽粒中具有较高的表达水平；OsNGCD3在萌芽期、三叶期的茎和叶及孕穗期的花序中的表达丰度较高；OsNGCD4在不同阶段的茎相比其他组织具有较高的表达水平。qRT-PCR分析结果显示，OsNGCD基因家族在11个水稻组织中的表达模式与RiceXPro数据库9个水稻组织的整体趋势基本一致，但也存在显著性差异。具体表现如下：（1）OsNGCD2在萌芽期呈现显著优势表达，表达量较其他组织高5倍左右；（2）OsNGCD3在三叶期的茎和叶片中的表达丰度明显升高。这些差异不仅验证了转录组数据的可靠性，更凸显了实验验证的必要性。本研究获得的组织特异性表达谱为阐明OsNGCD基因家族在水稻生长发育中的生物学功能提供了关键线索，并为后续开展基因功能验证和分子机制研究奠定了重要基础。
图 2 OsNGCD 蛋白的二级结构
Fig. 2 Secondary structure of OsNGCD proteins
图 3 OsNGCD 蛋白三级结构预测
Fig. 3 Tertiary structure prediction of OsNGCD proteins
此外，本研究还利用RiceXPro网站芯片数据分析了OsNGCD家族成员对多种植物激素处理30 min的响应情况。结果（图10）显示，OsNGCD家族所有成员的表达变化对生长素（IAA）的响应不显著。然而，所有OsNGCD成员的表达量均受到赤霉素（GA）的显著诱导升高。除OsNGCD3以外，其他3个成员（OsNGCD1、OsNGCD2和OsNGCD4）的表达量均受到油菜素内酯（brassinolide，BR）的显著诱导而降低。OsNGCD1和OsNGCD2的表达量还受到脱落酸（ABA）的诱导而升高。此外，OsNGCD1和OsNGCD2对 ABA 和 GA 呈现表达量协同升高的响应。这些结果不仅揭示了OsNGCD基因家族在激素信号转导中的重要作用，也为解析鞘脂代谢与植物激素网络的互作机制提供了新线索。特别是OsNGCD1/OsNGCD2在ABA-GA协同调控中的表现，可能与其在非生物胁迫响应中的功能密切相关。
图 4 OsNGCD家族成员基因结构分析
Fig. 4 Gene structure analysis of OsNGCD family members
图 5 OsNGCD 家族成员保守基序分析
Fig. 5 Conserved motif analysis of OsNGCD family members
2.7 非生物胁迫下OsNGCD基因的表达谱分析
本研究通过qRT-PCR系统分析了OsNGCD家族在盐（0.15 mol·L-1 NaCl）、碱（0.02 mol·L-1 NaHCO3∶Na2CO3）和干旱（15% PEG-6000）胁迫下的动态表达谱。结果（图11）表明，在胁迫处理1 d后，除OsNGCD2在干旱处理下相对表达量下降以外，其余基因家族成员在非生物胁迫下的表达水平均显著上升。随着处理时间的延长，大部分成员的表达量逐渐下降。在胁迫处理第3天时，干旱胁迫下OsNGCD1、OsNGCD3和OsNGCD4的基因表达量显著高于对照组，而OsNGCD4在盐胁迫和碱胁迫下的表达量与对照组无显著性差异。
图 6 OsNGCD 家族保守结构分析
Fig. 6 Conserved domain architecture of OsNGCD family
图 7 拟南芥和水稻同源蛋白的系统进化关系
Fig. 7 Phylogenetic relationships of homologous proteins between Arabidopsis and rice
在根系中，OsNGCD基因家族的表达模式与叶片有所不同（图12）。胁迫处理1 d后，所有基因家族成员的表达水平与处理前相比无显著变化。然而，随着处理时间的延长，盐胁迫处理下的OsNGCD1基因表达量显著高于对照组。在干旱胁迫第2天时，OsNGCD1和OsNGCD3的基因表达量显著低于对照组，而OsNGCD2在盐胁迫和碱胁迫下的表达量均高于对照组。
综上所述，OsNGCD基因家族在非生物胁迫响应中表现出显著的时空表达特异性。其中，OsNGCD1和OsNGCD4在叶片中受盐、碱和干旱胁迫诱导时，呈现快速且强烈的表达上调（24 h内），表明其可能在胁迫初期的快速响应中发挥关键作用。相比之下，OsNGCD2则表现出独特的根系优势表达模式，尤其是在胁迫后期（2 d和3 d），其表达量在根系中的上升幅度显著高于叶片，表明其可能在根系的长期胁迫适应中具有重要作用。OsNGCD3对盐、碱和干旱胁迫的响应相对较弱，其表达变化幅度较小，可能在胁迫响应中扮演辅助或调节的角色。这表明OsNGCD基因家族在水稻应对非生物胁迫过程中呈现出明显的组织特异性，并可能在胁迫响应中发挥重要作用。本研究首次从胁迫时间和空间两个维度揭示了OsNGCDs在单子叶植物中应对胁迫的转录变化规律。具体而言，从时间维度上，分析了从胁迫1 d到3 d的动态表达变化；从空间维度上，对比了根和叶片中的表达差异。这些发现为鞘脂代谢参与胁迫适应的分子机制提供了新的证据，并为培育抗逆性强的水稻品种提供了潜在的新基因资源。
3 讨论与结论
本研究通过全基因组分析鉴定出水稻中4个OsNGCD基因家族成员，并运用生物信息学手段对其蛋白结构、基因启动子、组织表达以及激素诱导等特性进行了全面剖析。此外，借助 qRT-PCR 技术，本研究深入分析了OsNGCD基因家族在盐、碱和干旱等非生物逆境胁迫下的时空表达特性。本研究结果表明，OsNGCD基因家族在水稻应对非生物胁迫过程中扮演着极为关键的角色。其成员在不同组织中的独特表达模式及对激素的特异性响应，揭示了该家族在逆境响应中潜在的重要功能，为深入理解水稻逆境适应机制提供了新的视角和理论依据。
图 8 OsNGCD 基因启动子的顺式作用元件预测分析
Fig. 8 Prediction analysis of cis-acting elements in OsNGCD genes promoters
图 9 OsNGCD基因在水稻不同组织中的表达分析
Fig. 9 Expression analysis of OsNGCD genes in different tissues of rice
图 10 植物激素处理30 min后OsNGCD 基因表达量变化的预测结果
Fig. 10 Predicted result of the expression of OsNGCD genes following 30 min of treatment with plant hormones
3.1 OsNGCD基因家族的功能推测与保守性分析
GCD是一种葡萄糖神经酰胺酶，拟南芥中的 4 个GCD蛋白与哺乳动物的GBA2具有同源性，但AtGCD3与GBA2存在功能差异，其对 GBA 的不可逆抑制剂 CBE 相对不敏感（Daniels et al., 1981；Premkumar et al., 2005；Walden et al., 2007；Ridley et al., 2013），并且优先水解长酰基链糖基神经酰胺（Dai et al., 2020）。本研究在水稻全基因组范围内鉴定出 4 个OsNGCD基因家族成员，它们与拟南芥的GCD基因存在不同程度的同源。不同物种间的同源基因可能具有相似功能（Matsubara et al., 2008；Seo et al., 2011；Coneva et al., 2012；Deng et al., 2017），基于这些证据，我们推测OsNGCD家族可能是葡萄糖神经酰胺水解酶家族，其成员可能在水稻中承担与拟南芥GCD相似的生物学功能。进一步的保守基序分析显示，4 个OsNGCD家族成员均含有 motif 1-motif 6，这些保守基序与OsNGCD结构域序列高度相关，表明OsNGCD基因家族在进化过程中保留了关键的功能结构域，为其在相似生物学过程中的功能发挥提供了结构基础。
3.2 OsNGCD基因家族的组织表达特异性与胁迫响应
组织特异性分析表明，OsNGCD1在三叶期根中特异性高表达；OsNGCD2主要富集于萌芽期、根系及蜡熟期籽粒，可能参与早期根系建成和籽粒成熟调控；OsNGCD3在萌芽期组织、三叶期茎和叶及孕穗期花序中表达突出，可能参与营养生长向生殖生长转换过程；OsNGCD4则在不同发育阶段的茎部持续高表达，凸显其对茎秆结构或功能的重要性。这表明OsNGCD基因家族成员可能在其表达量较高的组织中发挥特定功能，并且不同成员在水稻应对非生物胁迫时可能具有不同的作用机制和组织偏好性。
本研究揭示了水稻OsNGCD基因家族成员在非生物胁迫响应中的独特表达模式。与拟南芥同源基因相比，在PEG模拟干旱胁迫下，虽然在叶片组织中OsNGCDs与AtGCDs均呈现显著上调表达，但在根组织中却表现出相反的调控趋势，水稻中OsNGCD1-OsNGCD3基因表达下调，而拟南芥中gcd1-gcd3突变体基因表达上调（Li et al., 2025）。值得注意的是，盐胁迫条件下OsNGCD1-OsNGCD2在根中的表达模式同样与拟南芥同源基因存在显著性差异。AtGCD1和AtGCD3的CRISPR/Cas9基因编辑植株生长受到严重抑制（Li et al., 2025）。上述结果表明，在长期的进化过程中，单子叶和双子叶植物的葡萄糖神经酰胺酶基因家族可能已经分化出不同的胁迫响应调控网络，这一发现为深入解析OsNGCD基因家族的分子调控机制提供了新的研究视角。
3.3 启动子顺式作用元件与激素响应分析
启动子分析揭示了干旱响应元件（MBS）和激素响应元件（ABRE/GARE）的广泛存在，暗示这些基因可能参与胁迫适应性调控。网站芯片数据预测结果显示，OsNGCD家族基因成员的表达量受赤霉素（GA）诱导，OsNGCD1和OsNGCD2的表达量还受脱落酸（ABA）的诱导。已有研究表明，植物在干旱胁迫下，通过激活ABA信号通路，诱导增强 ABA的生物合成，调控下游基因表达，促使气孔关闭以降低蒸腾速率（黎家和李传友，2019）；油菜素内酯（BR）通过提高渗透与促进胁迫相关基因表达，以协同提升植株耐旱的存活率（Cui et al., 2019；Van Nguyen et al., 2021）；GA和ABA之间的信号互作对水稻响应干旱胁迫及维持生长和产量至关重要（Gowda et al., 2011；Oladosu et al., 2019）。在干旱胁迫处理下，OsNGCD1、OsNGCD3和OsNGCD4基因在叶片中表现出上调的表达模式，而在根系中则表现出下调的表达模式；相反，OsNGCD2在根系中表现出上调的表达模式，而在叶片中则表现出下调的表达模式。这表明OsNGCD基因家族成员可能在水稻面临干旱胁迫时受到不同激素的调控或协同调节，其表达模式的差异性反映了各基因在逆境响应中的复杂功能。
图 11 非生物胁迫下OsNGCD基因在叶片中的表达分析
Fig. 11 Expression analysis of OsNGCD genes in leaves under abiotic stress
4 展望
综上所述，本研究对鉴定的 4 个OsNGCD基因家族成员进行了综合分析。在水稻的不同组织部位以及非生物逆境胁迫处理下，该家族各成员表现出相似或不同的表达模式，这表明OsNGCD家族可能参与多种非生物逆境胁迫响应过程。这些发现为深入理解OsNGCD基因家族在水稻逆境响应中的功能提供了重要依据，也为培育抗逆性强的水稻品种提供了潜在的基因资源。然而，本研究仍存在一些局限性。例如，虽然我们推测OsNGCD家族可能是葡萄糖神经酰胺水解酶家族，但尚未通过实验验证其酶活性和底物特异性。有研究表明，渗透胁迫可诱导质膜-细胞壁连接结构的破坏，而质膜脂质组成的动态变化是植物适应环境胁迫的关键机制（Guo et al., 2019；Lamers et al., 2020）。此外，作为真核生物膜系统的重要结构组分，鞘脂代谢可能通过影响膜流动性参与胁迫信号转导（Cassim et al., 2019）。因此，我们推测OsNGCD基因家族可能通过调控膜脂代谢和鞘脂信号通路来维持逆境下膜系统的稳定性，进而响应非生物逆境胁迫。基于本研究结果，我们建议未来研究可着重关注以下关键科学问题：（1）OsNGCD基因在膜脂重塑过程中的分子作用机制；（2）单双子叶植物GCD基因功能分化的进化驱动力；（3）鞘脂代谢网络与植物抗逆性的调控关系。这些研究方向将有助于深入解析植物适应非生物胁迫的分子基础。为进一步明确 OsNGCD基因家族在逆境胁迫响应中的具体机制，可通过测定不同逆境胁迫条件下OsNGCD基因的表达量，并同步分析膜脂组的动态变化，揭示二者之间的时序关联。同时，可以基于转录组数据，构建与OsNGCD基因共表达的鞘脂代谢通路关键基因网络，分析其在逆境胁迫下的表达模式和相互作用；还可以利用OsNGCD过表达和基因编辑植物，分析其在非生物逆境胁迫下膜的完整性，并测定膜脂组成的变化，验证OsNGCD基因对膜系统稳定性的调控作用。这些研究将系统阐明OsNGCD基因在膜系统稳定性调控中的分子机制，为作物抗逆遗传改良提供新的靶点，有助于深入解析植物适应非生物胁迫的分子基础。
图 12 非生物胁迫下OsNGCD基因在根中的表达分析
Fig. 12 Expression analysis of OsNGCD genes in roots under abiotic stress
图 1 OsNGCD 蛋白多重序列比对分析
Fig. 1 Multiple sequence alignment of OsNGCD proteins
图 2 OsNGCD 蛋白的二级结构
Fig. 2 Secondary structure of OsNGCD proteins
图 3 OsNGCD 蛋白三级结构预测
Fig. 3 Tertiary structure prediction of OsNGCD proteins
图 4 OsNGCD家族成员基因结构分析
Fig. 4 Gene structure analysis of OsNGCD family members
图 5 OsNGCD 家族成员保守基序分析
Fig. 5 Conserved motif analysis of OsNGCD family members
图 6 OsNGCD 家族保守结构分析
Fig. 6 Conserved domain architecture of OsNGCD family
图 7 拟南芥和水稻同源蛋白的系统进化关系
Fig. 7 Phylogenetic relationships of homologous proteins between Arabidopsis and rice
图 8 OsNGCD 基因启动子的顺式作用元件预测分析
Fig. 8 Prediction analysis of cis-acting elements in OsNGCD genes promoters
图 9 OsNGCD基因在水稻不同组织中的表达分析
Fig. 9 Expression analysis of OsNGCD genes in different tissues of rice
图 10 植物激素处理30 min后OsNGCD 基因表达量变化的预测结果
Fig. 10 Predicted result of the expression of OsNGCD genes following 30 min of treatment with plant hormones
图 11 非生物胁迫下OsNGCD基因在叶片中的表达分析
Fig. 11 Expression analysis of OsNGCD genes in leaves under abiotic stress
图 12 非生物胁迫下OsNGCD基因在根中的表达分析
Fig. 12 Expression analysis of OsNGCD genes in roots under abiotic stress
表 1 OsNGCD家族成员qRT-PCR分析的引物序列
Table 1 Primer sequences for qRT-PCR analysis of OsNGCD family members
表 2 OsNGCD家族成员蛋白理化性质及亚细胞定位分析
Table 2 Physicochemical properties and subcellular localization of OsNGCD family members in rice
表 3 OsNGCD 蛋白二级结构预测
Table 3 Secondary structure prediction of OsNGCD proteins
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