摘要
该研究为揭示甘蓝型油菜（Brassica napus）MYB4转录因子在镉（Cd）胁迫响应中的作用，以高镉积累品种‘南油868’( 2n=4x=38, AACC)为材料，克隆获得一个MYB4基因，命名为BnaMYB4，并综合运用生物信息学分析、亚细胞定位及qRT-PCR技术，对其序列特征、蛋白性质及镉胁迫下的表达模式进行分析。结果表明：（1）BnaMYB4开放阅读框全长885 bp, 编码294个氨基酸；生物信息学分析显示其编码蛋白包含典型R2R3-MYB结构域，属于R2R3-MYB亚家族且被预测定位于细胞核。（2）多序列比对表明，BnaMYB4与甘蓝型油菜、拟南芥等物种的MYB4同源蛋白相似度较高（87.41%~98.97%）；启动子序列分析发现多个与逆境响应相关的顺式作用元件。（3）亚细胞定位实验证实BnaMYB4定位于细胞核。（4）组织表达分析显示，BnaMYB4在根、茎、叶中均有表达，其中根部表达量最高；Cd胁迫下，其在叶片中的表达量随胁迫浓度增加而轻微上升，在根部则呈轻微下降趋势。综上，BnaMYB4可能参与甘蓝型油菜对Cd胁迫的转录调控响应。该研究结果为深入解析MYB4在重金属胁迫中的功能机制及油菜抗逆育种提供了理论依据。
Abstract
This study aims to investigate the role of the MYB4 transcription factor in cadmium (Cd) stress response in rapeseed (Brassica napus). Using the high-Cd-accumulating cultivar ‘Nanyou 868’ (2n=4x=38, AACC) as experimental material, a MYB4 gene was cloned and named BnaMYB4. Bioinformatics analysis, subcellular localization, and qRT-PCR were comprehensively employed to investigate its sequence characteristics, protein properties, and expression patterns under Cd stress. The results were as follows: (1) The open reading frame of BnaMYB4 was 885 bp in length, encoding 294 amino acids; bioinformatics analysis indicated that the encoded protein contained a typical R2R3-MYB domain, belonging to the R2R3-MYB subfamily, and was predicted to localize in the nucleus. (2) Multiple sequence alignment revealed that BnaMYB4 shared high similarity (87.41%-98.97%) with MYB4 homologous proteins from species such as Brassica napus and Arabidopsis thaliana; promoter sequence analysis identified multiple stress-responsive cis-acting elements. (3) Subcellular localization experiments confirmed that BnaMYB4 localized in the nucleus. (4) Tissue expression analysis showed that BnaMYB4 was expressed in root, stem, and leaf, with the highest expression in root; under Cd stress, its expression in leaves slightly increased with increasing Cd concentrations, but decreased slightly in root. In conclusion, BnaMYB4 may be involved in the transcriptional regulatory response of rapeseed to Cd stress. This study provides a theoretical foundation for further elucidating the functional mechanism of MYB4 in heavy metal stress and for stress-resistance breeding in rapeseed.
转录因子作为调控基因表达的关键蛋白，通过特异性结合靶基因启动子区域的顺式作用元件，在植物生长发育、代谢调控及环境响应中发挥核心作用。其中，MYB转录因子家族因广泛参与植物初级/次生代谢、激素信号传导、细胞分化及生物/非生物逆境应答等过程而备受关注(张威等，2023)。该家族成员依据N端保守的DNA结合域（MYB重复结构域）数量被划分为1R-MYB、2R-MYB（R2R3-MYB）、3R-MYB和4R-MYB 4个亚类，其中R2R3-MYB亚类在植物中最为丰富，并在非生物胁迫耐受性中扮演关键角色(张威等，2023; 李泽凤等，2023)。
自Paz-Ares等(1987)首次从玉米（Zea mays）中克隆ZmMYBC1并证实其调控花青素合成以来，MYB转录因子的功能研究已取得显著进展。目前，水稻（Oryza sativa）(Yang et al., 2012)、拟南芥（Arabidopsis thaliana）(Wang et al., 2016)、野大豆（Glycine max）(Shen et al., 2018)、番茄（Solanum lycopersicum）(Liu et al., 2021)、小麦（Triticum aestivum）(Wei et al., 2020)、烟草（Nicotiana tabacum）(Yang et al., 2022)、神农香菊（Chrysanthemum indicum var. aromaticum）(李强等，2024)、生菜（Lactuca sativa）(张丽丽等，2024)等植物中的MYB基因已被成功克隆与功能验证。值得注意的是，R2R3-MYB亚类成员在重金属胁迫响应中的功能日益凸显。例如，拟南芥AtMYB4(Agarwal et al., 2020)和苎麻（Boehmeria nivea）BnMYB2(Zhu et al., 2020)通过调控解毒或转运蛋白的表达，显著增强植株对Cd的耐受性；Shiu等（2005）将神农香菊的CiMYB4基因进行遗传转化，成功提升了烟草和野菊（Chrysanthemum indicum）的耐Cd能力；此外，AtMYB49能促进Cd积累，其表达受脱落酸（abscisic acid，ABA）诱导(Zhang et al., 2019)。这些研究表明，R2R3-MYB转录因子在植物Cd耐受性机制中具有重要调控潜力。在芸薹属植物中，虽然关于MYB基因功能的研究已有若干报道，但MYB4在镉胁迫响应中的具体作用仍缺乏系统研究。例如，在白菜（Brassica rapa）和甘蓝型油菜（B. napus）中已鉴定出MYB4同源基因（如白菜XP_009101934.1和甘蓝型油菜XP_013705104.2），但这些基因在Cd胁迫下的表达模式、亚细胞定位及其在重金属耐受性中的具体功能仍不清楚。
尽管上述研究提示R2R3-MYB转录因子在植物Cd胁迫响应中具有普遍功能，但是在重要油料作物甘蓝型油菜中，MYB4同源基因（如BnaMYB4）是否同样参与Cd胁迫响应仍不清楚。基于此，本研究围绕以下关键科学问题展开：BnaMYB4是否编码典型R2R3-MYB转录因子并定位于细胞核；其在Cd胁迫下是否呈现表达响应及其组织特异性；该表达模式与模式植物（如拟南芥）或其他物种中的同源基因是否存在差异。解析上述问题不仅有助于揭示甘蓝型油菜Cd胁迫响应的独特分子机制，而且也将丰富植物重金属胁迫响应的理论体系，并为基于该基因的抗逆育种提供理论依据和基因资源。
本研究以高Cd积累油菜品种‘南油868’为材料，采用RT-PCR克隆、生物信息学分析、亚细胞定位及qRT-PCR表达分析等方法，系统解析BnaMYB4的序列特征、亚细胞定位及Cd胁迫下的表达模式，旨在明确：（1）甘蓝型油菜BnaMYB4是否编码典型R2R3-MYB转录因子；（2）其是否定位于细胞核并响应Cd胁迫；（3）Cd胁迫下该基因的组织表达特征。本研究结果将为揭示甘蓝型油菜Cd胁迫响应的分子机制及其抗逆育种提供重要理论支撑与候选基因资源。
1 材料与方法
1.1 材料
供试甘蓝型油菜‘南油868’(2n=4x=38, AACC)具有高产、高油、早熟、抗倒伏等特征，种子由凯里学院保存。
1.2 方法
1.2.1 BnaMYB4转录因子的克隆
根据NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)中公布的MYB4-3.1(KR076551)序列，采用Primer 5.0设计引物F1-MYB4(DPsen)（5′-ActagggtctcGCACCATGGGAAG GTCACCGTGTTGT-3′）、F2-MYB4(DPantisen)（5′-ActagggtctcTCGCC TTTCATCTCCAAGCTTCTAAAAC CAAA AAGAC-3′），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以‘南油868’的cDNA为模板进行RT-PCR扩增。总RNA提取自五叶期‘南油868’幼苗叶片，具体方法如下：采集正常生长条件下新鲜叶片，经液氮速冻后于-80 ℃保存，使用纳磁生物磁珠法植物RNA提取试剂盒提取总RNA，并通过1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，NanoDrop测定纯度与浓度。其cDNA合成方法如下：取1 μg总RNA，参照Evo M-MLV RT Mix Kit with gDNA Clean for qPCR Ver.2说明书进行反转录，获得cDNA。RT-PCR反应体系如下：2× PCR buffer 25 μL、2 mmol·L-1 dNTPs 10 μL、20 μmol·L-1正反向引物各1 μL、KOD-FX 1 μL、cDNA模板（100 ng·μL-1）1 μL，加灭菌ddH2O至总体积为50 μL。RT-PCR扩增程序如下：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，32 个循环；68 ℃最终延伸2 min。反应产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。将扩增产物胶回收，连接pEGOEP35S-H-GFP-GUS载体并测序。
1.2.2 生物信息学分析
将测序获得的BnaMYB4序列进行BLAST比对，搜索相似序列；用NCBI ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找开放阅读框；用ProtParam(http://www. expasy.ch/tools/protparam.html)分析编码蛋白的理化性质；用ClustalX2进行多序列比对；用MAGA 11.0构建系统进化树，Bootstrap重复1 000次；通过NCBICDD数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)预测蛋白功能结构域；用CELLO v2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)和WOLF PSORT进行亚细胞定位预测；用SignalP进行信号肽预测；用TMHMM Server v. 2.0进行跨膜区分析；用SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html)预测蛋白二级结构；用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive/4m8bPX/models/)预测三级结构。
1.2.3 BnaMYB4启动子序列分析
从油菜基因组数据库中获取BnaMYB4启动子区域（开放阅读框上游）2 000 bp，使用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析顺式作用元件。
1.2.4 BnaMYB4亚细胞定位
以绿色荧光蛋白作为报告基因，构建融合表达载体pEGOEP35S-H-MYB-GFP-GUS，将构建好的载体质粒通过电转化法转入农杆菌GV3101，30 ℃培养2 d，通过农杆菌介导法将过表达载体导入烟草叶片（挑选生长一个月，生长状况良好的烟草植株，用去针头的1 mL注射器从叶片下表皮注射并标记）。将注射后的烟草植株弱光培养2 d，取标记叶片制作玻片，在激光共聚焦显微镜下观察。GFP激发光波长488 nm、发射光波长510 nm，叶绿素激发光波长640 nm、发射光波长675 nm(Walter et al., 2004)。
1.2.5 qRT-PCR分析
选择饱满无病菌的‘南油868’油菜种子，经表面消毒后播种于1/2 MS固体培养基中，在25 ℃、16 h光照/8 h黑暗条件下培养20 d。选取生长一致的五叶期幼苗，移栽至含珍珠岩与蛭石（1∶1,V/V）混合基质的9 cm花盆中，每盆1株。植株在温室中继续培养至生长稳定后，进行Cd胁迫处理。设置3个Cd浓度处理组：0（对照）、5、10 mg·kg-1 Cd（以CdCl2·2.5H2O溶液形式），每处理组设3个生物学重复，每重复5株。对照浇灌等量蒸馏水。处理15 d后，观察植株生长情况并取样。取样时小心取出植株，用蒸馏水洗净根部基质，随后用10 mmol L-1 Na2-EDTA溶液浸泡20 min以去除根部表面吸附的Cd，最后用超纯水冲洗3次。分别采集根、茎、叶组织，液氮速冻后保存于-80 ℃备用。
采用纳磁生物磁珠法植物RNA提取试剂盒（货号NMR0311）提取各组织总RNA。参考Evo M-MLV RT Mix Kit with gDNA Clean for qPCR Ver.2说明书进行反转录，以其产物为qRT-PCR模板。利用SYBR Green Pro Taq HS 预混型qPCR试剂盒III，以油菜Actin7基因作为内参，使用ABI QuantStudio 6 Flex荧光定量PCR仪检测基因表达量。针对BnaMYB基因ORF序列设计qRT-PCR特异引物如下：QRT-BnaMYB-F（5′-TCGCTTATTGC TGG GAGATTAC-3′）、QRT-BnaMYB-R（5′-GTTGG ATCAATCCCTCGGTTTA-3′）、Actin7-F（5′-GCTGAC CGTATGAGCAAAG-3′）、Actin7-R（5′-AAGATGGA TGGACCCGAC-3′）。反应体系(20.0 μL)：10.0 μL 2×SYBR qPCR Master Mix，1.0 μL 20 ng·μL-1 cDNA，上、下游引物(10.0 μmol·L-1) 各0.4 μL，RNase Free Water 8.2 μL。扩增程序：95 ℃ 预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。溶解曲线程序：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s（以0.05 ℃·s-1速率升温）。采用2-ΔΔCT 法计算基因相对表达量(Livak & Schmittgen, 2001)。
2 结果与分析
2.1 ‘南油868’MYB4转录因子克隆
以‘南油868’叶片cDNA为模板进行PCR扩增，凝胶电泳显示片段约900 bp(图1)，与预期目的片段大小（885 bp）相符。回收该片段并测序，结果显示序列全长为885 bp（图2），编码1个由294个氨基酸组成的蛋白，命名为BnaMYB4，表明已成功克隆到甘蓝型油菜品种‘南油868’MYB4基因的完整编码区序列。
2.2 ‘南油868’ MYB4序列分析
对测序获得的BnaMYB4编码序列进行BLAST分析，结果显示其编码的氨基酸序列与已报道的甘蓝型油菜MYB4蛋白（KAH0871872.1）相似性高达98.97%，与灰毛山芥菜（Barbarea grayi）MYB4（KAJ0229970.1）相似性为94.56%，与模式植物拟南芥的AtMYB4（NP_195574.1）相似性为87.41%。这说明BnaMYB4在十字花科植物中具有较高的序列保守性，并且成功克隆到了目标基因。
图
1
BnaMYB4 PCR扩增
Fig.
1
BnaMYB4 PCR amplification
2.3 ‘南油868’MYB4蛋白理化性质分析
利用ProtParam工具对BnaMYB4蛋白的理化性质进行预测。结果显示，该蛋白分子量约为33.10 kDa，等电点（pI）为8.78，表明其在生理pH条件下可能带正电荷。蛋白不稳定系数为46.98，根据阈值（<40为稳定），提示该蛋白可能属于不稳定蛋白。总平均亲水性（GRAVY）为-0.662，表明BnaMYB4为亲水蛋白，这与大多数可溶性转录因子的特性一致。
2.4 ‘南油868’MYB4蛋白结构域、保守基序及系统进化分析
序列比对显示，BnaMYB4与多数十字花科植物MYB4氨基酸序列高度一致(图3)，系统进化树分析（图4）进一步表明，BnaMYB4与甘蓝型油菜自身的MYB4蛋白聚为一支，亲缘关系最近，其次与其他十字花科植物（如萝卜、拟南芥）的MYB4聚在一起，而与山茶、辣椒等非十字花科植物的MYB4亲缘关系较远。该进化关系符合物种分类规律，暗示BnaMYB4在功能上可能与十字花科近缘物种的MYB4更为相似。
保守结构域分析（图5）显示，BnaMYB4含有典型的SANT结构域（对应于R2和R3重复序列），这是R2R3-MYB转录因子的DNA结合域。此外，还鉴定出多个R2R3-MYB亚家族的特征保守基序，如C1、C2、Zf-like和C4基序。这些分析结果共同证实BnaMYB4属于R2R3-MYB转录因子家族，具备作为转录调控因子的基本结构基础。
图
2
MYB4转录因子的cDNA序列及预测氨基酸序列
Fig.
2
cDNA sequence and deduced amino acid sequence of MYB4 transcription factor
2.5 BnaMYB4的亚细胞定位预测
利用CELLO v2.5和WOLF PSORT软件对BnaMYB4进行亚细胞定位预测。两种软件的结果均显示，BnaMYB4最可能定位于细胞核（表1、图6）。作为转录因子，定位于细胞核是其发挥转录调控功能的必要条件，该预测结果初步支持BnaMYB4具有转录因子的潜在功能。
2.6 BnaMYB4蛋白的信号肽及跨膜预测
通过SignalP 6.0预测，BnaMYB4的N端不存在典型的信号肽切割位点（图7），表明它不属于通过经典分泌途径运输的分泌蛋白。TMHMM预测结果（图8）显示，该蛋白无明显的跨膜螺旋结构。这两项分析表明，BnaMYB4是一种非跨膜和非分泌的可溶性细胞内蛋白，这与其作为核定位转录因子的特性相符。
2.7 BnaMYB4蛋白二级结构预测
使用SOPMA在线工具对BnaMYB4的二级结构进行预测。结果（图9）显示，该蛋白的二级结构主要由无规则卷曲（59.86%）构成，其次是α-螺旋（23.47%）和延伸链（16.67%）。较高的无规则卷曲比例常与蛋白质的结构柔性和功能多样性相关，这可能有助于BnaMYB4与不同的DNA序列或互作蛋白结合，以适应复杂的转录调控需求。
2.8 BnaMYB4蛋白三级结构预测
利用在线工具（如SWISS-MODEL）预测了BnaMYB4蛋白的三级结构。如图10所示，该模型呈现出典型的植物R2R3-MYB转录因子结构特征，包含两个保守的MYB结构域（R2和R3）形成的螺旋-转角-螺旋折叠。模型的质量评估指标QMEAN Z评分为-4.91，表明该预测模型具有合理的可信度。该结构预测结果进一步从生物信息学角度支持了BnaMYB4属于MYB转录因子R2R3亚家族成员的结论。
2.9 BnaMYB4启动子顺式元件分析
为探究BnaMYB4基因的表达调控机制，我们对其翻译起始位点上游2 000 bp的启动子区域进行了顺式作用元件分析。如表2所示，除TATA-box和CAAT-box等核心启动子元件以外，还发现了多种与非生物胁迫和激素响应相关的元件。其中包括与防御及胁迫响应相关的TC-rich repeats元件，响应水杨酸的TCA-element，响应生长素的TGA-element，响应赤霉素的P-box，以及光响应相关的GATA-motif、MRE和LAMP-element等。这些元件的存在强烈暗示BnaMYB4的表达可能受到多种环境信号（包括重金属胁迫）和植物激素的精细调控，为其参与Cd胁迫响应提供了潜在的转录水平调控依据。
2.10 BnaMYB4亚细胞定位验证
为验证BnaMYB4的细胞内定位，本研究构建了BnaMYB4与绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的融合表达载体（35S::BnaMYB4-GFP），并通过农杆菌介导的瞬时转化法在烟草叶片表皮细胞中表达。激光共聚焦显微镜观察结果如图11所示，表达BnaMYB4-GFP融合蛋白的细胞中，绿色荧光信号特异性地聚集在细胞核内，呈现出清晰的点状或团块状分布模式。然而，表达空载体GFP对照的细胞中，绿色荧光均匀分布在整个细胞（包括细胞核和细胞质）中。本实验结果与生物信息学预测结果完全一致，确证BnaMYB4是一个定位于细胞核的蛋白，符合其作为转录因子的细胞学定位特征。
图
3
BnaMYB4与部分植物MYB4氨基酸序列比对
Fig.
3
Amino acid sequence alignment of BnaMYB4 with MYB4 from other plant species
2.11 镉胁迫下油菜中BnaMYB4的表达
通过qRT-PCR技术，检测了BnaMYB4在甘蓝型油菜根、茎、叶中的基础表达及其在Cd胁迫下的变化（图12）。在未受胁迫的对照（0 mg·kg-1 Cd）植株中，BnaMYB4呈现出组织特异性表达模式，其在根中的相对表达量最高（2.45），显著高于茎（1.00）和叶（1.18）。这表明BnaMYB4可能在根系生理活动中具有更重要的基础功能。
在镉胁迫处理下，BnaMYB4表现出组织特异性调控。在叶片中，随着镉浓度（5、10 mg·kg-1）的增加，BnaMYB4的表达量呈现轻微但逐步上调的趋势，分别比对照上升了13.5%和22.9%。这种上调可能意味着BnaMYB4参与了叶片应对镉毒害的防御反应，例如通过调控抗氧化或解毒相关基因的表达。在茎中，BnaMYB4的表达对Cd胁迫响应不明显，在5 mg·kg-1 Cd下与对照持平，在10 mg·kg-1 Cd下略有下降，说明茎组织可能不是BnaMYB4响应Cd胁迫的主要部位。
图
4
BnaMYB4蛋白与其他物种MYB4 蛋白系统进化树分析
Fig.
4
Phylogenic tree analysis of BnaMYB4 protein and MYB4 proteins from other species
图
5
BnaMYB4蛋白保守结构域分析
Fig.
5
Conserved domain analysis of BnaMYB4 protein
值得注意的是，在根中，尽管本底表达量最高，但在Cd胁迫下其表达变化模式与叶片不同。在5 mg·kg-1 Cd处理下，根中BnaMYB4表达量较对照有14.3%的上升，但在更高浓度10 mg·kg-1Cd下，上升幅度减小至9.8%。‘南油868’作为高镉积累品种，其根系可能已具备一套固有的耐受机制，BnaMYB4的调控可能更侧重于稳态维持或与其他信号通路的协同，而非简单的表达量大幅波动。此外，根系作为镉吸收和感知的第一线，其转录调控网络更为复杂，BnaMYB4的表达可能受到多层级反馈调节。
表
1
BnaMYB4蛋白亚细胞定位预测
Table
1
Subcellular localization prediction of BnaMYB4 protein
注: nucl. 细胞核; cyto. 细胞色素氧化酶。
Note: nucl. Nucleus; cyto. Cytochrome oxidase.
图
6
BnaMYB4蛋白亚细胞定位预测和分析
Fig.
6
Subcellular localization prediction and analysis of BnaMYB4 protein
总体而言，BnaMYB4在Cd胁迫下表现出组织差异性的表达调控，尤其在叶片中呈现正响应，在根中响应幅度较小，这提示BnaMYB4可能在不同组织中通过不同的调控途径参与甘蓝型油菜对Cd胁迫的适应性反应。
图
7
BnaMYB4蛋白信号肽分析
Fig.
7
Signal peptide analysis of BnaMYB4 protein
图
8
BnaMYB4蛋白跨膜区域分析
Fig.
8
Transmembrane region analysis of BnaMYB4 protein
图
9
BnMYB4蛋白二级结构预测
Fig.
9
Secondary structure prediction of BnMYB4 protein
图
10
BnMYB4蛋白三级结构预测模型
Fig.
10
Predicted tertiary structure model of BnaMYB4 protein
3 讨论与结论
本研究克隆的BnaMYB4与拟南芥AtMYB4等同源蛋白高度相似（>87%）且其启动子含有TC-rich repeats等逆境响应元件，支持其参与胁迫响应的潜力。然而，与拟南芥AtMYB4在Cd胁迫下表达显著上调的报道(Agarwal et al., 2020)不同，本研究中BnaMYB4在Cd胁迫下的表达变化相对平缓（叶片轻微上调，根部轻微下调）。这种差异可能反映了物种或品种特有的调控策略。‘南油868’作为高镉积累品种，其耐受机制可能更侧重于稳态维持和转录后调控，而非依赖转录水平的剧烈变化。此外，Zhu等(2020)在高镉积累苎麻中发现的BnMYB2在Cd胁迫下表达量并未发生显著变化。这一现象提示，在高积累型植物中，某些MYB转录因子可能采取一种相对温和的转录响应模式，这更倾向于体现为耐受机制而非主动的回避策略。其功能调控可能并非依赖于转录丰度的显著改变，而是通过蛋白活性调节或与其他信号通路之间的交叉来实现更为精细的胁迫适应。
本研究的亚细胞定位证实BnaMYB4定位于细胞核，符合其作为转录因子的功能基础。组织表达分析显示BnaMYB4在根中本底表达最高，暗示其在根部初级胁迫感知与信号传导中可能具有重要作用。根部作为植物与土壤环境直接接触的主要器官，是镉吸收、转运与解毒的关键部位。BnaMYB4在根中高表达可能与其参与根系发育、离子稳态维持、抗氧化防御或重金属螯合等过程有关，为根系应对Cd胁迫提供了转录调控基础。然而，Cd胁迫下根部表达仅轻微变化，可能与根系为减少镉吸收或调整金属转运策略而进行的转录重编程有关。这与Wang等(2022)中MYB转录因子在根中响应胁迫的模式相似，但也突出了甘蓝型油菜作为高积累作物在调控逻辑上的潜在独特性。
表
2
BnaMYB4启动子区顺式作用元件分布及功能
Table
2
Distribution and function of cis-acting elements in BnaMYB4 promoter
图
11
BnaMYB4蛋白的亚细胞定位
Fig.
11
Subcellular localization of BnaMYB4 protein
本研究首次在甘蓝型油菜中系统报道了MYB4的克隆、特性及Cd胁迫下的表达模式，并揭示了其与模式植物拟南芥在表达响应趋势上的差异。这一发现为理解芸薹属植物特别是高积累品种在重金属胁迫下独特的转录调控网络提供了新线索。BnaMYB4可能通过调控抗氧化系统、螯合剂合成或金属转运蛋白等下游靶点参与镉耐受，其轻微的转录变化可能意味着翻译后修饰（如磷酸化、泛素化）或蛋白互作网络在调控其活性中扮演更重要角色，这与其他研究中MYB蛋白的调控模式一致(何锐等，2025)。
图
12
不同浓度Cd处理下BnaMYB4基因在油菜中的表达情况
Fig.
12
Expression of BnaMYB4 gene in Brassica napus under different cadmium concentration treatments
然而，本研究仍属初步探索。BnaMYB4的具体下游靶基因、蛋白活性是否受镉诱导的翻译后修饰调控，以及其是否与bHLH、WRKY等其他转录因子形成复合物以协同响应胁迫，均有待深入解析。未来研究应通过构建过表达或敲除材料进行功能验证，并利用酵母单杂交、ChIP-seq或互作组学技术鉴定其直接调控的基因及互作蛋白，从而全面阐明BnaMYB4在甘蓝型油菜Cd胁迫响应中的分子机制。
综上所述，本研究结果表明：（1）BnaMYB4 编码一个典型的R2R3-MYB转录因子，其序列特征、结构域及进化关系均支持这一分类；（2）该蛋白定位于细胞核，符合转录因子的功能定位，并在Cd胁迫下表现出组织特异性表达响应；（3）其在根中本底表达最高，暗示其可能在根系Cd胁迫响应中发挥基础调控作用，而在Cd胁迫下，其响应模式为叶片轻微诱导，根部变化不明显，提示BnaMYB4 可能通过不同组织中的调控机制参与甘蓝型油菜对Cd胁迫的适应过程。这些发现为进一步解析 BnaMYB4 在重金属胁迫中的功能机制及油菜抗逆育种提供了重要依据。