摘要
伪响应调节因子（pseudo-response regulators，PRRs）是调节植物昼夜节律与开花期的关键因子，在多种植物中的功能已得到广泛验证。然而，该基因家族在棉花物种中的进化路径与生物学功能尚不清晰。为系统解析棉花PRR基因家族的进化特征及其潜在功能，该文整合BLASTP、Pfam及NCBI数据库，对从4类棉花物种，即亚洲棉（Gossypium arboreum）、雷蒙德氏棉（G. raimondii）、陆地棉（G. hirsutum）、海岛棉（G. barbadense）以及模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中鉴定得到的32个PRR基因进行了进化分析与表达模式研究。结果表明：（1）PRR基因分为3个进化上保守的亚类（A、B、C），其起源早于单子叶与双子叶植物的分化；所有成员均含CCT结构域，多数具有CCT-Response_reg双结构域。（2）PRR基因的启动子区域在不同物种间存在显著异质性，亚洲棉中以胁迫及光响应元件（如ABRE、ACE）为主，而陆地棉与海岛棉中的启动子则扩展至防御机制、激素响应和光信号传导（如MYB、G14K）。（3）PRR基因具有组织特异性表达和胁迫响应分化，其中Ghir_D12G025960在纤维和胚珠中富集，Ghir_D11G001640表现为冷诱导但受盐/干旱胁迫抑制，Ghir_D12G025960在热胁迫下呈现先抑制后恢复的独特表达动态。该研究系统解析了棉花PRR基因的结构多样性、进化关系及其在发育与胁迫响应中的功能分化，为棉花生物钟调控机制研究与抗逆育种提供了重要基因资源与理论依据。
Abstract
Pseudo-response regulators (PRRs) are key regulators of plant circadian rhythms and flowering time, with their functions having been extensively validated across a wide range of plant species. However, the evolutionary trajectory and biological roles of this gene family in cotton remain poorly understood. To systematically dissect the evolutionary characteristics and potential functions of the PRR gene family in cotton, this study integrated data from BLASTP, Pfam, and NCBI databases to perform evolutionary analyses and expression pattern investigations on 32 PRR genes identified from four cotton species — Gossypium arboreum, G. raimondii, G. hirsutum, G. barbadense — as well as the model plant Arabidopsis thaliana. The results were as follows: (1) The PRR genes were clustered into three evolutionarily conserved subclasses (A, B, and C), whose origin predated the divergence of monocotyledonous and dicotyledonous plants. All PRR members contained CCT domain, while the majority possessed a dual CCT-Response_reg domain architecture. (2) Significant heterogeneity was observed in the promoter regions of PRR genes among different cotton species, those in Gossypium arboreum were dominated by stress- and light-responsive elements (e.g., ABRE, ACE), whereas promoters in G. hirsutum and G. barbadense had expanded to include elements associated with defense mechanisms, hormone signaling, and light signal transduction (e.g., MYB, G14K). (3) PRR genes exhibited tissue-specific expression patterns and divergent stress response profiles. Specifically, Ghir_D12G025960 was highly enriched in fibers and ovules; Ghir_D11G001640 was induced by cold stress but repressed under salt or drought conditions; and Ghir_D12G025960 displayed a unique expression dynamic of initial inhibition followed by recovery under heat stress. This study comprehensively characterizes the structural diversity, evolutionary relationships, and functional differentiation of cotton PRR genes in development and stress responses. These findings provide valuable genetic resources and a theoretical framework for future research on the cotton circadian clock regulatory network and the genetic improvement of stress tolerance in cotton breeding.
Keywords
生物钟是植物中一种关键的时间调控机制，其通过将生物过程与昼夜环境周期同步，确保关键发育事件在时间上的精确性（Young & Kay, 2001; Yuan et al., 2021; Xu et al., 2022b）。植物能够将日照长度（光周期）作为可靠的季节变化信号，进而调控多个重要生理过程，包括开花转变、块茎形成、形态建成、光合作用、胁迫耐受性及免疫反应等，以适应环境变化（Hotta et al., 2007; Song et al., 2015; Xu et al., 2022a; Yu et al., 2023）。光周期严格调控光周期诱导的开花过程，而昼夜节律振荡器则作为解读24 h周期信号的核心组件（Imaizumi, 2010）。
光周期开花受复杂遗传网络的精密调控，在该通路中，光感受器首先感知光信号并将其传递至生物钟，生物钟随后产生节律性输出以调控下游基因表达（Salomé & McClung, 2005）。在拟南芥等植物中，核心生物钟组分包含CCT（CONSTANS/CONSTANS-LIKE/TOC1）基因家族成员，尤以伪响应调节因子（pseudo-response regulators，PRRs）为代表（Putteril et al., 1995; Zhang L et al., 2015;Jin et al., 2018; Yuan et al., 2021）。PRRs蛋白由CCT结构域（1段43~45个氨基酸的保守序列）所定义，并依据基序组成划分为3个亚家族：COL（CO-like）、CMF（CCT motif family）与PRR（Cockram et al., 2012）。该类蛋白与细菌双组分系统中的响应调节因子在序列上具有显著同源性（Dunlap, 1999）。在结构上，PRRs蛋白通常包含1个N端受体样结构域（RLD）与1个C端CCT结构域（Mizuno, 2005; Farré & Liu, 2013）。除已知在抑制光周期开花中发挥作用以外，PRRS蛋白还参与调控多种植物生理过程（Makino et al., 2000; Mizuno & Nakamichi, 2005）。
PRR基因作为昼夜节律振荡器的核心组分，对植物生长发育具有重要调控作用。其在光周期开花调控中的功能在进化上较为保守（Ito et al., 2003），并与MYB类转录因子LATE ELONGATED HYPOCOTYL（LHY）和CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1（CCA1）形成反馈调控环路（Mizuno & Nakamichi, 2005）。Pruneda-Paz等（2009）研究表明，PRR1基因可直接调控CCA1与LHY的表达水平；PRR7作为关键的光周期调节因子，通过抑制下游靶基因参与调控植物生长、发育、开花及非生物胁迫响应。在拟南芥中，PRR7的过表达会抑制CCA1/LHY的表达，破坏正常昼夜节律并影响活性氧代谢平衡（Nakamichi et al., 2010; Lai et al., 2012）。此外，生物钟的调控范围还延伸至众多参与盐、脱水、渗透及冷胁迫应答的基因（Kreps et al., 2002）。例如，高粱（Sorghum bicolor）PRR37基因（SbPRR37）的表达受光感受器PHOT基因调控，进而影响开花时间；而PRR5-VP在拟南芥中被证实可显著增强植株对低温、干旱及高盐胁迫的耐受能力（Nakamichi et al., 2016）。综上表明，PRR基因在提高作物环境适应性、胁迫抗性及生物量方面具有重要潜力。
尽管PRR基因在大部分植物中的功能已有较为系统的研究，但在棉花这一重要经济作物中，其家族成员的进化路径、结构分化规律及其在纤维发育与逆境响应中的调控机制仍不明确。为系统解析棉花PRR基因的进化与功能特征，本研究围绕以下3个核心问题展开：（1）明确棉花PRR基因家族在进化过程中的功能分化特征；（2）揭示棉花PRR基因启动子调控元件的物种特异性；（3）阐明PRR基因在棉花组织发育及逆境响应中的调控作用。基于上述目标，本研究整合染色体定位、基因结构、保守基序与系统进化分析，结合四倍体棉花不同组织的表达谱及胁迫诱导表达数据，系统鉴定PRR家族成员并深入解析其结构特征与表达模式，以期为揭示昼夜节律核心组分PRR在棉花光周期响应与胁迫应答中的分子机制提供新的见解。
1 材料与方法
1.1 PRR基因家族成员的鉴定
为系统地鉴定拟南芥及4个棉花物种中的伪响应调节因子基因，本研究采用标准生物信息学流程进行分析：（1）以已知PRR核心蛋白序列为查询模板，对目标物种蛋白质组进行BLASTP同源搜索（Camacho et al., 2009）（E值<1e-5）；（2）基于高分片段对整合结果，利用Genewise软件预测完整编码区及外显子-内含子结构；（3）通过比对物种特异性参考蛋白质组去除冗余序列，并借助Pfam（Mistry et al., 2021）数据库验证PRR特征结构域（包括Rec receiver结构域与pseudo-phosphatase结构域）的存在。
1.2 PRR蛋白的系统发育分析
对获得的PRR完整蛋白序列通过MUSCLE28（Edgar, 2004）进行多序列比对后，采用IQ-TREE软件构建最大似然系统发育树（设置1 000次超快速自举重复），通过iTOL（Letunic & Bork, 2007）平台完成进化树的可视化与注释。
1.3 PRR蛋白的结构表征
对鉴定的PRR蛋白进行结构特征分析，基序分析：采用MEME Suite28检测保守基序（参数设置为最大基序数10，基序宽度6~50个氨基酸。基因结构分析：基于TBtools和GFF3文件，结合CottonGen（Wang et al., 2019）和 NCBI Batch CD-Search（Marchler-Bauer et al., 2015）绘制外显子-内含子结构图。
1.4 启动子顺式调控元件分析
通过使用PlantCARE（Lescot et al., 2002）扫描启动子区域（转录起始位点上游3 000 bp）以识别顺式调控元件（CAREs）；通过R语言中的ggplot2对元件的分布进行统计分析并可视化。
1.5 物种间共线性分析
利用MCScanX（Wang et al., 2012）识别鉴定棉花基因组间的同源基因对（筛选标准为相互最佳BLASTP命中，E值< 1e-10）及共线性区块，并通过jcvi.graphics.synteny（Tang et al., 2024）与Matplotlib工具可视化共线性关系。
1.6 RNA-seq数据处理
从NCBI SRA/GEO（Zhang T Z et al., 2015）获取陆地棉TM-1品种的公共RNA-seq数据，经质量控制和修剪后，使用HISAT2与StringTie进行序列比对与转录本组装，并计算获得FPKM表达量。
1.7 PRR基因的表达谱分析
整合来自COD（Ahmad et al., 2021）数据库及本研究前述步骤的FPKM数据，利用TBtools（Chen et al., 2023）进行基因水平的Z-score标准化与层次聚类分析，并通过热图展示不同条件下PRR基因的表达模式。
2 结果与分析
2.1 棉花PRR基因的全基因组鉴定与定位
为系统解析棉花PRR基因家族，本研究整合BLASTP、Genewise、Pfam及NR数据库，对亚洲棉（Gossypium arboreum）、雷蒙德氏棉（G. raimondii）、陆地棉（G. hirsutum）、海岛棉（G. barbadense）和拟南芥展开全基因组PRR基因鉴定。经NCBI Batch CD-Search严格验证，共鉴定到32个PRR基因。染色体定位结果显示，PRR基因在棉花26条染色体上呈不均匀分布。基因数量分析表明，雷蒙德氏棉、陆地棉、海岛棉、亚洲棉分别包含6个、8个、9个和4个PRR基因，而拟南芥中仅鉴定到5个同源基因，显示出物种间PRR基因数量的显著差异（图1）。
图
1
PRR基因拷贝数在植物物种间的分布
Fig.
1
Distribution of PRR gene copy numbers across plant species
2.2 棉花PRR基因的系统发育分类与保守性分析
为阐明棉花PRR基因的进化关系，本研究对4个棉花物种及拟南芥中的PRR同源基因进行了系统发育分析。通过MUSCLE进行多序列比对，并基于IQ-TREE2构建最大似然系统发育树（采用BNNI优化以提高拓扑结构可靠性）。系统发育拓扑结构显示，棉花PRR基因家族可分为3个明显区分的亚类：Class A、Class B与Class C（图2），该分类反映了PRR基因在植物进化过程中可能发生的功能分化。进一步分析表明，4种棉花基因组均保留至少4个PRR基因拷贝，显示该家族在棉花中具有较高的保守性。系统发育结构同时支持三类主要PRR进化枝的形成早于单子叶与双子叶植物的分化事件，暗示其功能在早期植物进化中已建立。
2.3 保守结构域与染色体分布揭示棉花PRR亚家族特征
结构分析表明，所有鉴定到的棉花PRR亚家族成员均包含保守的CCT结构域（PF06203）。其中，大多数成员同时具有Response_reg结构域（PF00072），形成在光周期感知与昼夜节律调控中发挥关键作用的典型双结构域架构。与之相比，Gbar_A12G025730与Gbar_A09G017210两个基因仅编码CCT结构域，提示其功能可能特异化为CCT介导的转录调控，体现了该亚家族的功能分化（表1）。
图
2
棉花物种PRR基因系统进化树
Fig.
2
Phylogenetic tree of PRR genes in Gossypium species
表
1
不同植物物种间PRR基因成员结构域组成
Table
1
Domain composition of PRR gene members among different plant species
为进一步解析PRR基因的基因组分布特征，本研究通过染色体定位分析进行了系统作图。结果显示，在亚洲棉（染色体Chr01-Chr13）与雷蒙德氏棉（Chr01-Chr13）中，PRR基因呈现明显的非均匀分布，具体表现为Garb_01G008970与Grai_04G014620等基因的特异性定位（图3）。类似的空间分布模式在海岛棉与陆地棉中同样被观察到，包括Ghir_A03G007900与Gbar_A03G007910等代表性基因（图4）。这表明PRR基因在棉花染色体上存在保守的空间分布异质性，反映了其在基因组组织层面的进化约束。
为探究PRR基因家族的结构保守性，利用MEME软件对4个棉花物种及拟南芥中代表性PRR蛋白进行了基序组成分析，共识别出10个保守基序（Motif 1-Motif 10）。尽管在长度与排列顺序上存在轻微差异，但是不同物种间的整体基序分布模式表现出高度的保守性。值得注意的是，几乎所有PRR成员均具有Motif 4、Motif 3与Motif 1的连续排列结构，暗示该组合可能构成PRR蛋白功能活性的核心功能模块。此外，棉花物种陆地棉、海岛棉和亚洲棉的基序结构较雷蒙德氏棉和拟南芥的更为复杂，提示其在基因重复事件后可能发生功能分化。这表明PRR基因家族在进化过程中保持了高度保守的基序架构，反映了其在植物生物节律调控及胁迫响应中的共同功能（图5）。
2.4 棉花PRR基因启动子中顺式调控元件的差异分布
对PRR亚家族基因转录起始位点上游3 kb启动子区域的顺式作用元件分析显示，不同棉花物种间存在明显的调控功能分化。在亚洲棉（如Garb_12G030220）中，启动子区域主要富集ABRE、ACE等胁迫与光响应元件（图6）；而在陆地棉和海岛棉（如Ghir_D12G025960）中，则包含更多样的调控基序，如MYB结合位点与G14K等，表明其调控网络可能涉及防御反应、激素信号转导及光周期调控等多个生理过程（图7）。上述结果表明，不同棉花物种PRR亚家族在顺式调控元件组成上具有显著性差异，反映了其潜在的适应性分化。
2.5 共线性分析揭示棉花PRR基因的进化保守性
为阐明4个棉花物种中PRR基因家族的进化关系，本研究采用MCScanX与jcvi工具进行了共线性分析。结果（图8）显示，海岛棉与陆地棉之间具有保守的共线性关系。此外，在不同棉花物种中均发现由1~2个PRR基因构成的共线性基因对，进一步支持该基因家族在进化过程中的功能保守性。
图
3
PRR基因在亚洲棉（A）和雷蒙德氏棉（B）中的染色体分布
Fig.
3
Chromosomal distribution of PRR genes in Gossypium arboreum (A) and G. raimondii(B)
2.6 转录组分析揭示棉花PRR基因的组织特异性表达模式
为解析PRR基因在陆地棉中的空间表达特征，本研究对已发表的RNA-seq数据进行分析，涵盖种子、叶片和根等组织。结果（图9）表明，PRR家族成员在不同组织间存在显著的表达差异。其中，Ghir_D09G016400、Ghir_A11G001650与Ghir_D12G025960在多数组织中普遍高表达，Ghir_D12G025960在胚珠与纤维组织中表达丰度最高。与之相反，Ghir_A12G025940在所有检测组织中表达水平持续较低。值得注意的是，Ghir_D03G010390在胚珠成熟阶段特异性上调，而Ghir_D11G001640则主要在根组织中呈现显著转录激活。上述表达模式表明，棉花PRR基因受到严格的组织特异性调控，可能与其在器官发育中的功能分化密切相关。
图
4
PRR基因在陆地棉（A）和海岛棉（B）中的染色体分布
Fig.
4
Chromosomal distribution of PRR genes in Gossypium hirsutum(A) and G. barbadense(B)
图
5
4个棉花物种及拟南芥中PRR基因家族成员的保守基序组成
Fig.
5
Conserved motifs in the PRR gene family of four Gossypium species and Arabidopsis thaliana
图
6
亚洲棉（A）和雷蒙德氏棉（B）中PRR基因启动子中的顺式作用元件
Fig.
6
Cis-acting elements in PRR gene promoters of Gossypium arboreum(A) and G. raimondii(B)
2.7 棉花PRR基因的胁迫响应表达谱分析
为解析棉花PRR基因在非生物胁迫下的表达调控特征，本研究基于公共RNA-seq数据库对四倍体陆地棉进行了分析。结果（图10）显示，Ghir_D03G010390与Ghir_A12G025940在高温、低温及干旱胁迫下均未发生显著转录水平变化。与之形成对比，Ghir_D11G001640的表达呈现胁迫特异性调控：在冷胁迫下显著上调，而在盐与干旱胁迫下则明显受到抑制。值得注意的是，Ghir_D12G025960在热胁迫处理中表现出独特的动态恢复模式，其转录水平在胁迫初期短暂下降，随后随时间推移逐渐恢复至原有水平。综上表明，棉花PRR基因在应对不同环境胁迫时具有多样性且特异性的表达调控策略。
3 讨论与结论
3.1 PRR基因家族的进化与结构分化暗示其功能复杂性
系统发育分析将棉花PRR基因划分为A、B、C 3个古老亚类，其起源早于单子叶与双子叶植物的分化（Ito et al., 2003），这表明PRR基因在植物生物钟进化中具有深远保守性。PRR基因拷贝数（4~9个）较拟南芥（5个）更为复杂，反映了棉花基因组进化过程中的特异性。值得注意的是，本研究发现了2个仅含CCT结构域而缺乏典型Response_reg结构域的PRR成员（Gbar_A12G025730、Gbar_A09G017210），这一特殊的结构特征提示，它们可能因独立于经典的磷酸信号转导通路而发挥特异性调控功能（Mizuno, 2005; Cockram et al., 2012; Farré & Liu, 2013）。这一发现拓展了我们对PRR蛋白功能模式的理解，即该家族可能通过“结构域丢失”这种模块化进化方式，产生新的调控分支，以应对更为复杂的发育与环境信号整合需求。
图
7
陆地棉（A）和海岛棉（B）中PRR基因启动子中的顺式作用元件
Fig.
7
Cis-acting elements in PRR gene promoters of Gossypium hirsutum(A) and G. barbadense(B)
图
8
棉花物种间PRR基因的共线性分析
Fig.
8
Synteny analysis of PRR genes among Gossypium species
图
9
陆地棉PRR基因的组织特异性表达模式
Fig.
9
Tissue-specific expression patterns of PRR genes in Gossypium hirsutum
图
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陆地棉PRR基因的胁迫响应表达谱
Fig.
10
Stress-responsive expression profiles of PRR genes in Gossypium hirsutum
3.2 启动子元件的物种特异性预示差异化的调控网络
对PRR基因启动子区的分析显示，不同棉花物种在顺式调控元件的构成上存在显著异质性。亚洲棉中ABRE、ACE等胁迫与光响应元件的富集，表明其PRR基因的转录可能更直接地受逆境和光信号驱动，反映了其对原始生长环境的适应性。相比之下，陆地棉与海岛棉中MYB、G14K等元件的扩展，则揭示了其在驯化与育种过程中，调控网络复杂性的增加，可能将激素信号（如ABA、JA）、防御反应以及光周期感知更精细地整合到生物钟调控网络。这种调控层面的分化不仅是回答“启动子调控元件是否具有物种特异性”这一问题的直接证据，而且还从顺式调控进化的角度为解释不同棉种在抗逆性与适应性上的差异提供了潜在机制。
3.3 组织与胁迫特异性表达模式揭示PRR基因的生物学功能
表达谱分析为解答“PRR基因是否参与棉花组织发育与逆境响应”提供了关键线索。Ghir_D12G025960基因在纤维和胚珠中的特异性高表达，暗示其是调控棉花生殖发育和纤维形成的关键候选基因，推测它可能通过整合生物钟信号与激素通路（如生长素、赤霉素），进而调控纤维细胞的起始、伸长或次生壁的加厚过程（Makino et al., 2000; Mizuno & Nakamichi, 2005）。此外，Ghir_D11G001640基因在非生物胁迫下呈现出独特的“胁迫二分性”：在冷胁迫下被诱导，而在盐/干旱胁迫下被抑制，与拟南芥中报道的PRR功能存在差异（Nakamichi et al., 2010）。这一现象揭示了生物钟调控的高度情境特异性，这种差异化的响应策略反映了棉花PRR基因在协调生长与抗逆之间精密平衡中的核心作用。
此外，Ghir_D12G025960在热胁迫下表现出的“先抑制后恢复”的动态模式，有可能与生物钟的“门控”机制有关（Nakamichi et al., 2010; Lai et al., 2012）。初期抑制可能是机体在突然胁迫下的保护性反应，而后续的恢复则预示着生物钟系统在感知环境压力缓解后，主动重建转录稳态，这对于植物在波动环境中的生存与恢复至关重要。
综上，本研究不仅解答了关于棉花PRR基因功能分化、物种特异性调控及其生物学角色的核心科学问题，更重要的是，将PRR基因从保守的生物钟组件，提升为连接昼夜节律、纤维品质形成与逆境适应性的关键枢纽。本研究结果为棉花分子设计育种提供了宝贵的基因资源和坚实的理论依据，对未来培育环境适应性强、纤维品质优的棉花新品种具有重要指导意义。