摘要
辣椒黄化环斑病毒（CYRSV）严重危害多种经济作物和园艺作物，其主要功能基因N、NSs、NSm与病毒侵染密切相关，构建N、NSs、NSm基因病毒诱导的基因沉默（VIGS）体系以研究其致病功能尚未有报道。为构建CYRSV N、NSs、NSm基因的VIGS体系，分析N、NSs、NSm基因在CYRSV侵染中的作用，该研究将CYRSV N、NSs、NSm基因的300 bp左右靶片段分别构建到pTRV2沉默载体上，在不同接种模式下检测各基因的沉默效率，最后选择最佳接种模式，并在本氏烟和辣椒中进行沉默效率检测，应用绝对实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法检测N、NSs、NSm基因的拷贝数。结果表明：（1）在本氏烟上，N、NSs、NSm基因的VIGS体系的沉默效率分别为82.07%、87.02%、94.39%；在辣椒上，N、NSs、NSm基因的VIGS体系的沉默效率分别为86.63%、89.22%、83.43%。（2）成功构建了CYRSV N、NSs、NSm基因的VIGS体系，能高效抑制CYSRV侵染本氏烟和辣椒过程中N、NSs、NSm基因的拷贝数，沉默效率在82%至95%之间。该研究构建的N、NSs、NSm基因的VIGS体系为后续研究CYRSV的致病机理提供了前期材料，也为CYRSV抗病育种和田间绿色防控提供了一定的理论依据。
关键词
Abstract
Chilli yellow ringspot virus (CYRSV) causes severe diseases in many economically important plants such as cash crops and horticultural flora, its major functional genes (N、NSs、NSm) are closely related to viral infection. However, no report has described the construction of a virus-induced gene silencing (VIGS) system containing N, NSs, NSm genes to study its pathogenic function. To address this, a VIGS system was constructed for the N, NSs and NSm genes of CYRSV, and the roles of these genes during CYRSV infection were analyzed. Approximately 300 bp target fragments of CYRSV N, NSs and NSm genes were respectively inserted into the pTRV2 silencing vector. The silencing efficiency of each gene was detected under different inoculation modes. The optimal inoculation method was selected and further validated in Nicotiana benthamiana and pepper plants. The copy number of N, NSs and NSm genes was quantified using absolute quantitative real-time PCR (qRT-PCR). The results were as follows: (1) The silencing efficiencies for VIGS system of N, NSs, NSm were 82.07%, 87.02%, and 94.39% in N.benthamiana, respectively, and 86.63%, 89.22%, 83.43% in pepper, respectively, compared with the control group. (2) This study successfully established a VIGS system targeting the N, NSs and NSm genes of CYRSV, which effectively inhibited the copy number of N, NSs and NSm genes in N. benthamiana and pepper, with silencing efficiencies ranging from 82% to 95%. The N, NSs and NSm VIGS system developed in this study provides preliminary materials for future investigations into the pathogenesis of CYRSV and offers a theoretical basis for resistance breeding and environmentally friendly control strategies in the field.
在中国，已报道了多种正番茄斑萎病毒属病毒，包括番茄斑萎病毒（tomato spot wilt virus，TSWV）、辣椒褪绿病毒（CaCV）、西瓜银斑病毒（WSMoV）等。2014年，在云南红河哈尼族彝族自治州石屏县采集到一株表现出叶片黄环斑和坏死症状的辣椒植株，从中分离出了一种正番茄斑萎病毒属（Orthotospovirus）病毒，并命名为辣椒黄化环斑病毒（chilli yellow ringspot virus，CYRSV）（Zheng et al., 2020）。目前，由正番茄斑萎病毒属病毒侵染辣椒、番茄等作物引起的病毒病已经成为全球范围的主要病毒病害（刘勇等，2019；于海龙等，2020）。近十年来，正番茄斑萎病毒病在中国迅速扩散，现已蔓延到19个省份。寄主植物感染正番茄斑萎病毒属病毒后的症状极其相似，主要症状包括环斑（如褪绿斑、黄斑、坏死斑和带状斑）、芽坏死、银色斑驳和脉带。褪绿斑、黄斑和坏死斑可出现在病毒侵染的所有阶段（早期、中期和晚期）（Zhang et al., 2021）。
辣椒黄化环斑病毒（CYRSV）属布尼亚病毒目（Bunyavirales）番茄斑萎病毒科（Tospoviridae）正番茄斑萎病毒属病毒。CYRSV侵染寄主后，植株会表现出生长受限、矮缩，叶片出现黄化环斑、紫脉等症状；果实会出现褪绿黄化、同心圆斑和黄化环斑等症状；感染严重的植株会出现坏死。CYRSV与其他正番茄斑萎病毒属病毒相似，是直径大小为80~ 120 nm的球状病毒，为三分体基因组，包含大、中、小3个基因片段，编码主要CYRSV功能蛋白的基因有N、NSs和NSm基因，以及编码糖蛋白的Gn/Gc和编码RNA聚合酶的RdRp，这些主要功能基因与病毒的分类、运动及系统侵染能力均有密切联系。其中，N基因编码CYRSV的结构蛋白-核衣壳蛋白，NSm和NSs编码CYRSV的非结构蛋白，NSm编码与病毒迁移、传播相关的蛋白，NSs编码病毒沉默抑制子（杨婷婷等，2022）。目前，有关CYRSV侵染机制的研究仍处于空白阶段。N蛋白是正番茄斑萎病毒属病毒中最稳定、最保守的蛋白，N蛋白序列相似度是用于鉴定划分种和血清组的主要依据（张仲凯等，2004；陈坤荣等，2005；桂敏等，2022）。因此，利用核壳体蛋白基因（N）设计引物进行RT-PCR 扩增现已成为鉴定该属病毒的关键方法。CYRSV在国内尚未见详细研究报道，因此研究CYRSV功能蛋白对深入研究CYRSV病毒侵染机制尤其重要。
病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）是指将目的基因片段构建至VIGS载体上，获得重组病毒载体，注射植株后，随着病毒的感染与扩散，激发植物免疫反应机制，进而实现对靶基因的沉默（任恒泽等，2024）。VIGS具备操作简便、完成高效、周期时间短、无需获取转基因植株、高通量等优势，是研究功能基因组和特定基因功能的有力工具（侯巧明等，2015；魏正欣等，2022）。VIGS的沉默效率和插入片段与目的基因的同源性程度密切关联。一般而言，VIGS的沉默效率和插入片段与靶基因两者的同源性越高，病毒诱导引发的基因沉默效率也越高（张丽英，2022）。2019年，Choi等人研发了基于蚕豆萎蔫病毒（broad bean wilt virus，BBWV）的VIGS 载体，并在多种辣椒品种中成功抑制了PDS基因，这也为辣椒作物基因功能方面的研究提供了新的VIGS工具（郝梦媛等，2022）。目前，关于CYRSV中N、NSm和NSs基因的VIGS体系相关研究还未见报道。构建CYRSV主要功能蛋白相关沉默载体对深入研究CYRSV病毒侵染机制尤其重要，本研究将CYRSV N、NSs、NSm基因的300 bp左右靶片段分别构建到pTRV2沉默载体上，以农杆菌介导的方法注射到本氏烟和辣椒中，2 d后对本氏烟进行CYRSV摩擦接种。注射12 d后采集系统叶应用绝对实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法检测N、NSs、NSm基因的拷贝数。本研究运用VIGS技术构建N、NSm和NSs基因沉默载体，可以更好地了解该病毒的遗传结构与作用机制，为深入研究CYRSV的致病机理提供研究材料和有力依据，为实现CYRSV的绿色防控提供理论依据和实验手段。
本研究以构建CYRSV的主要功能基因N、NSs、NSm为研究对象，基于pTRV载体的VIGS体系，采用同源重组和实时荧光定量PCR的方法，构建了CYRSV N、NSs、NSm基因的VIGS体系，拟探讨以下问题：（1）N、NSs、NSm基因的VIGS体系的靶基因片段长度；（2）N、NSs、NSm基因的VIGS体系在本氏烟中的效率；（3）VIGS体系和CYRSV接种的时间先后；（4）CYRSV侵染过程中N、NSs、NSm基因的重要性。
1 材料与方法
1.1 实验材料
辣椒黄化环斑病毒毒源、本氏烟（Nicotiana benthamiana）和辣椒品种‘思椒’种子均由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所植物病毒团队保存提供。pTRV1、pTRV2载体，以及pTRV2-PDS沉默载体来自云南农业大学李凡教授课题组。
1.2 N、NSs和 NSm基因VIGS靶序列扩增
按照本实验室扩增测序获得CYRSV N、NSs、NSm编码序列选择靠近5′端300 bp左右的序列作为VIGS沉默靶序列，并以同源重组的方法设计引物：pTRV2-N、pTRV2-NSs、pTRV2-NSm引物序列见表1，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以实验室保存的感染CYRSV的番茄cDNA为模板（Zhang et al., 2025），应用2×Accurate Taq 预混液（湖南艾科瑞生物工程有限公司）扩增N、NSs和NSm基因目的片段。PCR反应体系：2 × Accurate Taq Master Mix 12.5 μL、模板1 μL、引物上下游各0.5 μL、ddH2O 10.5 μL。PCR程序：94 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共34个循环；72 ℃最终延伸2 min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，UV凝胶成像系统拍照。将扩增产物按照琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒（苏州优逸兰迪生物科技有限公司）说明书进行DNA回收纯化，以获得目的基因。
1.3 N、NSs和 NSm的VIGS载体构建及农杆菌转化
采用限制性内切酶 BamH I对pTRV2载体进行单酶切，酶切反应体系（总量50 μL）：模板2 μL、10 × Buffer 5 μL、BamH I 1 μL、ddH2O 42 μL。反应程序为37 ℃孵育20 min。将单酶切产物进行DNA纯化后测定浓度备用，保证浓度足够。根据OK Clon DNA连接试剂盒Ⅲ（湖南艾科瑞生物工程有限公司）说明书操作，用2.5 × OK Clon Ligation Kit Ⅱ试剂盒将目的基因与pTRV2载体连接起来，反应体系（总量 10 μL）：2.5 × OK Clon Master Mix 4 μL、pTRV2载体 4 μL、基因片段 2 μL。反应程序为50 ℃反应10 min。将以上连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含卡那霉素抗性的LB平板上筛选单克隆，将单克隆进行菌落PCR鉴定，最后将PCR阳性克隆菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，经序列比对分析，测序正确的阳性克隆菌液按照Trelief® Plasmid Mini Kit Plus高纯度质粒小提试剂盒进行质粒提取，最终获得的重组载体质粒为pTRV2-N、pTRV2-NSs、pTRV2-NSm。将重组质粒pTRV2-N、pTRV2-NSs、pTRV2-NSm通过液氮速溶法转入农杆菌 GV3101 感受态细胞中，在卡那霉素（100 mg·L-1）和利福平（50 mg·L-1）的抗性条件下筛选阳性菌。用PCR扩增引物进行菌液PCR验证，有目的条带的阳性克隆菌液为pTRV2-N、pTRV2-NSs、pTRV2-NSm重组载体农杆菌菌液。
表
1
引物序列
Table
1
Primer sequences
1.4 VIGS载体农杆菌注射及CYRSV接种方法
侵染液配制：50 mL灭菌水、50 μL AS、25 μL MES、500 μL MgCl2。将摇匀的菌液以5 000 r·min-1转速离心10 min，弃上清液。在常温下，3 000 × g离心收集pTRV2-N、pTRV2-NSs、pTRV2-NSm、pTRV2-PDS、pTRV1及pTRV2载体菌体，使用适量的侵染液分别悬浮适量的菌沉淀，分光光度计测OD值，保证菌液OD值为0.6~1.0，28 ℃恒温培养箱避光静置6~8 h待用。浸染注射：分别将载体pTRV2-N、pTRV2-NSs、pTRV2-NSm、pTRV2-PDS以及pTRV2的侵染液与pTRV1侵染液按1∶1的体积比充分混匀，使用1 mL注射器吸满侵染液，利用针头轻柔地戳待注射叶片的下表皮（选择生长状况良好适合的本氏烟和辣椒叶片），用左手食指轻轻抵住上表皮，将针筒对准针眼孔缓慢注射，侵染液进入叶片的四分之一即可。摩擦接种CYRSV：先将研钵放在冰上，再将CYRSV毒源从-80 ℃冰箱中取出，加入适量PBS缓冲液，在研钵中研磨碎后用金刚砂和棉签摩擦接种CYRSV，随后在温室中继续培养。组别设置如下：pTRV2组（注射VIGS空体系菌液并接种CYRSV，注射顺序与对应目标基因VIGS体系一致）；CYRSV 2 d+pTRV2-N/NSs/NSm-10 d组（CYRSV接种2 d后注射N/NSs/NSm-VIGS体系，10 d后取样）；CYRSV+pTRV2-N/NSs/NSm-10 d组（CYRSV接种后马上注射N/NSs/NSm-VIGS体系，10 d后取样）；pTRV2-N/NSs/NSm-2 d+ CYRSV 10 d组（N/NSs/NSm-VIGS体系注射2 d后接种CYRSV，10 d后取样）；pTRV2-N/NSs/NSm-5 d+ CYRSV 10 d组（N/NSs/NSm-VIGS体系注射5 d后接种CYRSV，10 d后取样）；pTRV2-N/NSs/NSm-8 d+ CYRSV 10 d组（N/NSs/NSm-VIGS体系注射8 d后接种CYRSV，10 d后取样）；每组包含3株本氏烟或辣椒，实验重复3次。同时，设置pTRV1/pTRV2-PDS菌液注射的本氏烟作为指示对照。
1.5 N、NSs、NSm绝对实时荧光定量 PCR 标准曲线的建立
Pimer 3.0 Plus在线设计N、NSs、NSm的实时荧光定量PCR引物，序列见表1。PCR的反应体系（总量25 μL）：2×Accurate Taq Master Mix 12.5 μL、cDNA 1 μL、引物上下游各0.5 μL、ddH2O 10.5 μL。PCR程序：94 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共34个循环；72 ℃最终延伸2 min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。将扩增产物进行胶回收后，连接在pMD-T19克隆载体（宝生物工程大连有限公司）上，反应体系如下：pMD19-T Vector 1 μL、DNA模板1 μL、ddH2O 3 μL；加入5 μL的Solution Ⅰ。反应程序为16 ℃反应30 min（PCR仪）。将PCR阳性克隆菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，经序列比对分析，测序正确的阳性克隆菌液按照Trelief® Plasmid Mini Kit Plus高纯度质粒小提试剂盒进行质粒提取，最终获得N、NSs、NSm/pMD-T19质粒标准品；对质粒标准品进行浓度测定，依据拷贝数的计算公式：拷贝数（copies·μL-1）=A×6.02×1023/B[A为质粒浓度（g·μL-1）；B为质粒DNA分子量（g·mol-1）]，计算出每个质粒标准品的病毒拷贝数；将N、NSs、NSm/pMD19-T质粒梯度稀释成具有10倍浓度梯度的标准品，分别用于建立N、NSs和NSm基因的标准曲线。
以CYRSV-qN-F/R、CYRSV-qNSs-F/R、CYRSV-qNSm-F/R为荧光定量PCR引物，采用SYBR® Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）进行荧光定量PCR反应，荧光定量PCR反应体系（总量10 μL）如下：标准品 1 μL、2×SYBR Green Pro Taq HS Premix 5 μL、10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL、ddH2O 3 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s（40 个循环），95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。增加溶解曲线，以标准品的CT值作为纵坐标，相应拷贝数的对数作为横坐标，建立CYRSV N、NSs和NSm基因的标准曲线。
1.6 N、NSs、NSm的VIGS载体沉默效率验证
所采叶片样品总 RNA 按照SteadyPure植物RNA提取试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）说明书进行提取。将总RNA按照Evo M-MLV反转录预混型试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）说明书进行反转录，各样本cDNA稀释5倍后待用，荧光定量PCR检测步骤同1.5。各样品中N、NSs、NSm基因的拷贝数计算：将待测样品CT值代入对应标准曲线中，计算待测样品中N、NSs、NSm基因的拷贝数，随后乘以稀释倍数5，即为各样本中N、NSs、NSm基因的拷贝数。按照公式计算每个基因拷贝数的沉默效率，沉默效率（%）=（C-T）/ C×100（C为仅接种 CYRSV 病毒的植株叶片中目的基因拷贝数的平均值；T为注射VIGS沉默载体的植株叶片目的基因的平均拷贝数值）。
2 结果与分析
2.1 CYRSV N、NSs、NSm的VIGS载体构建及农杆菌转化结果
N、NSs和NSm基因的VIGS靶片段大小分别为307、303、300 bp，PCR扩增后电泳观察目的条带位置正确（图1：A），并送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，将测序比对成功的PCR产物进行胶回收，测浓度后备用。将上一步回收的靶片段与酶切回收后的pTRV2载体进行同源重组。经过转化筛选，挑选单克隆进行菌落PCR检测（图1：B）。将PCR检测条带位置正确的阳性克隆菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，经序列比对分析，将测序正确的阳性克隆菌液扩繁后进行质粒的抽取，最终成功获得重组载体质粒pTRV2-N、pTRV2-NSs、pTRV2-NSm。测得pTRV2-N浓度为544.941 ng·μL-1，pTRV2-NSs浓度为498.822 ng·μL-1，pTRV2-NSm浓度为483.800 ng·μL-1。利用液氮速溶法，将上述质粒及pTRV2-PDS分别转入农杆菌GV3101感受态细胞中，挑选单克隆进行菌落PCR检测（图1：C）。PCR条带位置正确，表明成功获得了pTRV2-N、pTRV2-NSs、pTRV2-NSm及pTRV2-PDS重组载体农杆菌菌液，可继续开展后续的沉默效率检测。
2.2 N、NSs、NSm基因绝对实时荧光定量 PCR 标准曲线的建立
以CYRSV-qN、qNSs、qNSm引物进行PCR扩增获得目的片段（图2：A），将目的条带胶回收后克隆到pMD19-T载体上，经菌落PCR（图2：B）后将测序正确的阳性克隆进行质粒提取，最终成功获得N/pMD19-T、NSs/pMD19-T、NSm/pMD19-T重组载体，浓度分别为298.5、355.7、429.0 ng·μL-1。利用公式计算出N/pMD19-T、NSs/pMD19-T和NSm/pMD19-T质粒的拷贝数分别为0.94×1011、1.10×1011 和1.10×1011。依次将标准质粒稀释成8个拷贝数浓度，N/pMD19-T质粒的拷贝数梯度为0.94×102、0.94×103、0.94×104、0.94×105、0.94×106、0.94×107、0.94×108，NSs/pMD19-T和NSm/pMD19-T的拷贝数梯度均为1.1×102、1.1×103、1.1×104、1.1×105、1.1×106、1.1×107、1.1×108。实时荧光定量PCR检测后，以拷贝数的对数作为横坐标，CT值作为纵坐标，分别绘制CYRSV N、NSs、NSm的标准曲线（图3）。N基因标准曲线方程为y=-3.279 9x+37.15（R2=0.997 5）；NSs基因标准曲线方程为y=-3.235 1x+38.332（R2=0.998 4）；NSm基因标准曲线方程为y=-3.140 3x+35.409（R2=0.998 0）。R2系数越接近1，表明实验操作精准度越高，在N、NSs、NSm基因的标准曲线中，CT值与标准质粒浓度之间呈现出良好的线性关系，可用于后续拷贝数分析。
图
1
pTRV2/N、NSs、NSm重组载体及农杆菌菌落的琼脂糖凝胶电泳检测结果
Fig.
1
Results of pTRV2/N, NSs, NSm recombinant vector and agrobacterium colony by agarose gel electrophoresis
图
2
N、NSs、NSm片段及其T载体菌落的 PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果
Fig.
2
Results of PCR products for N, NSs, NSm fragments and their T vector colonies by agarose gel electrophoresis
2.3 不同接种方法下，pTRV2-N、pTRV2-NSs、pTRV2-NSm的VIGS体系在本氏烟中的沉默效率检测
pTRV2-PDS作为VIGS体系的指示对照，PDS-VIGS载体注射烟草后12 d，烟草叶片出现白化症状，pTRV2空载体植株则没有出现任何表型变化（图4），这表明实验所用的VIGS体系和侵染方法在本氏烟中成功发挥作用。
图
3
CYRSV N、NSs、NSm基因的绝对实时荧光定量PCR标准曲线
Fig.
3
Standard curves of absolute qRT-PCR for CYRSV N, NSs and NSm genes
图
4
pTRV2-PDS和pTRV2空载体侵染后本氏烟叶片的光漂白症状
Fig.
4
Photobleaching of Nicotiana benthamiana after pTRV2-PDS and pTRV2 empty vector inoculation
为了探索不同接种模式下pTRV2-N、pTRV2-NSs、pTRV2-NSm VIGS体系的沉默效率，我们在本氏烟中设置了5种接种模式：模式1为CYRSV接种2 d后注射VIGS体系（CYRSV 2 d+pTRV2-N/NSs/NSm 10 d）；模式2为CYRSV接种后马上注射VIGS体系，10 d后取样（CYRSV+pTRV2-N/NSs/NSm 10 d）；模式3为VIGS体系注射2 d后接种CYRSV，10 d后取样（pTRV2-N/NSs/NSm 2 d+CYRSV 10 d）；模式4为VIGS体系注射5 d后接种CYRSV，10 d后取样（pTRV2-N/NSs/NSm 5 d+CYRSV 10 d）；模式5为VIGS体系注射8 d后接种CYRSV，10 d后取样（pTRV2-N/NSs/NSm 8 d+CYRSV 10 d）。绝对定量检测对应基因的拷贝数，与相应的对照组（pTRV2）相比，5种接种模式下对应的3种基因拷贝数均为明显降低，除N和NSm的模式1以及NSm和NSs的模式5差异不显著以外，其余均显著降低（图5）。其中，3种基因的模式3沉默效率最高，分别为81.57%、76.52%和88.19%。这表明VIGS体系注射2 d后再接种CYRSV，接种10 d后CYRSV对应基因的沉默效率最高。
2.4 pTRV2-N、pTRV2-NSs、pTRV2-NSm的VIGS体系在本氏烟和辣椒中的沉默验证
根据以上不同接种模式下pTRV2-N、pTRV2-NSs、pTRV2-NSm的VIGS体系在本氏烟中的沉默效率，优先选择先注射VIGS体系2 d后再接种CYRSV的方法在本氏烟和辣椒中进行再次验证，并在CYRSV接种后10 d收集叶片样本进行沉默效率分析。由图6可知，注射了pTRV2空载体并摩擦接种CYRSV的本氏烟出现明显心叶卷曲和坏死症状，而分别注射了pTRV2-N、pTRV2-NSs、pTRV2-NSm的VIGS侵染液再接种CYRSV的本氏烟只出现了心叶卷曲并无坏死症状且注射了pTRV2-N的心叶卷曲程度最小；注射了pTRV2空载体并摩擦接种CYRSV的辣椒叶片出现明显的黄化环斑症状，而分别注射了pTRV2-N、pTRV2-NSs、pTRV2-NSm VIGS的辣椒叶片症状则明显减轻。这表明本文建立的N、NSs、NSm VIGS体系成功抑制了CYRSV的侵染。
为进一步验证重组病毒载体pTRV2-N、pTRV2-NSs、pTRV2-NSm在本氏烟中对CYRSV的沉默效果，我们采用实时荧光定量PCR技术检测对应本氏烟和辣椒中CYRSV的N、NSs、NSm基因的拷贝数。结果如图7所示，pTRV1/pTRV2-N、pTRV1/pTRV2-NSs、pTRV1/pTRV2-NSm农杆菌注射本氏烟和辣椒后，对应基因的拷贝数均显著下调。N基因在本氏烟和辣椒中的沉默效率分别为82.07%和86.63%；NSs基因在本氏烟和辣椒中的沉默效率分别为87.02%和89.22%；NSm基因在本氏烟和辣椒中的沉默效率分别为94.39%和83.43%。这表明通过pTRV2载体构建N、NSs、NSm基因沉默载体的沉默效率在82%至95%之间，此载体适用于辣椒黄化环斑病毒功能基因沉默载体的构建。
图
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不同接种模式下本氏烟中CYRSV N、NSs、NSm基因的拷贝数
Fig.
5
Copy numbers of N, NSs and NSm genes of CYRSV in Nicotiana benthamiana under different inoculation modes
图
6
pTRV2-N、NSs、NSm和pTRV2侵染再接种CYRSV后本氏烟和辣椒叶片的症状
Fig.
6
Symptoms of Nicotiana benthamiana and pepper leaves infected with CYRSV after inoculation with pTRV2-N, NSs, NSm and pTRV2
图
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CYRSV N、NSs、NSm基因在本氏烟和辣椒中的拷贝数
Fig.
7
Copy number of CYRSV N, NSs and NSm genes in Nicotiana benthamiana and pepper
3 讨论与结论
CYRSV在云南省红河州地区首次被发现，主要为害辣椒，近两年来，该病毒蔓延到云南省元谋县，给当地的经济作物造成严重损失。采取生物防治和抗病毒育种等方法来防治CYRSV病毒已迫在眉睫。为了解CYRSV主要蛋白的功能作用，进一步探索CYRSV的侵染机制，本研究通过设计并构建高效的CYRSV主要功能蛋白VIGS体系，运用绝对荧光定量PCR技术验证VIGS体系的沉默效率，为后续研究CYRSV主要功能蛋白的作用提供材料支撑，也为解析CYRSV致病机制提供理论支持。
目前，VIGS技术已成熟并广泛应用于烟草、玉米、水稻、拟南芥、小麦和番茄等多种作物，将作物的内源基因沉默以研究其对植物生长发育及其他功能影响的研究已比较丰富。但是，关于植物病毒相关基因的VIGS体系研究报道仍然不多，而构建CYRSV主要功能蛋白编码基因的VIGS体系研究尚未见报道。VIGS体系主要是利用含烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）功能基因的载体（pTRV1和pTRV2）来实现，目的基因靶片段主要克隆到pTRV2载体上，随后与pTRV1一起共同侵染植株，达到使目的基因表达沉默的效果。本研究将CYRSVN、NSs和NSm基因的300 bp左右靶片段扩增后构建到pTRV2载体上，与pTRV1载体共同注射到本氏烟和辣椒叶片中，显著降低了病毒的N、NSs和NSm基因的拷贝数，实现了基因沉默的效果。我们设计的靶片段长度均在300 bp左右，沉默效率较高，这与以往文献报道的将基因全长编码序列及其中150 bp左右序列构建到VIGS载体上的情况不同，靶片段太小或太长不利于PCR扩增，容易造成片段不纯或碱基突变，并且在侵染植株后容易造成脱靶，导致基因沉默效率不高。
本研究采用5种不同的接种模式来验证CYRSV 3种基因VIGS体系在本氏烟中的沉默效率，其中沉默效率最高的模式是VIGS体系注射2 d后接种CYRSV，其次沉默效率较好的模式是CYRSV接种后马上注射VIGS体系以及VIGS体系注射5 d后接种CYRSV，而CYRSV接种2 d后注射VIGS体系和VIGS体系注射8 d后接种CYRSV的模式下沉默效率较低，甚至沉默无显著性差异。分析其原因可能是由于VIGS体系在植株中发挥作用至少需要2 d，2 d后接种病毒效果最佳；而VIGS注射时间大于2 d或过长再接种病毒，由于VIGS体系是瞬时接种，注射时间过长且体内没有病毒的情况下，就会导致VIGS在植株内作用不是最佳时机，沉默效率就可能降低；而CYRSV接种后马上注射VIGS体系这种模式，由于病毒和VIGS体系前两天都同时处于扩繁和积累的准备阶段，当VIGS在发挥作用的最佳时期，病毒也同样处于繁殖最佳时期，因此沉默效率也会减弱。但是，先接种病毒后2 d注射VIGS体系这种模式，由于病毒先通过2 d的积累复制时间，体内病毒可能已经充分繁殖和活跃，病毒繁殖正处于上升阶段，再注射VIGS体系的话，沉默效率就会大大减弱。通过以上摸索实验，我们选择VIGS体系注射2 d后再接种CYRSV的最佳模式，进一步在本氏烟和辣椒中进行验证。通过绝对荧光定量PCR检测发现N、NSs、NSm基因在本氏烟中的沉默效率分别为82.07%、87.02%、94.39%，在辣椒中的沉默效率分别为86.63%、89.22%、83.43%。邱润霜等（2020）报道了先注射VIGS载体后接种病毒和先接种病毒后注射VIGS载体2种方法对TSWV的沉默效果，发现先注射载体后接种病毒的方式要比先接种病毒后注射载体的方式沉默效率高，这与本文检测结果一致。本文所构建N、NSs、NSm基因的VIGS体系的沉默效率在82%至95%之间，再次证明了先注射VIGS载体后接种病毒方式的可行性和高效性，原因可能是VIGS载体注射过后会在48~96 h时复制达高峰，这时如果接种病毒，病毒基因表达会在早期就被沉默干扰，进而影响病毒复制和装配，达到高效沉默的目的。反之，如果病毒接种后才注射VIGS载体，可能病毒已经在宿主中进行复制和装配，产生了许多病毒粒子，这时注射VIGS载体，VIGS体系只能沉默部分病毒基因，或者病毒复制速度大于VIGS沉默作用，进而导致VIGS沉默效率不高。此外，在大田条件下，病毒的侵染具有随机性，延续的时间会很长。作为预防措施，更需要提前进行预防免疫接种，因此先注射VIGS体系后接种病毒是达到病毒高效沉默的因素之一。VIGS技术的沉默效率在很大程度上依赖于寄主植物与病毒间的相互作用，除此之外，VIGS技术的沉默效率与寄主的生长环境、病毒积累的环境也紧密相关（李姣等，2019）。本研究中的实验都严格在恒温恒湿的温室中进行，VIGS侵染液吸光度值严格控制在0.6，高浓度的菌液会造成植物死亡（胡锦瑜等，2024）。另外，病毒在植株内的侵染和复制特点也应该考虑在内，因为VIGS体系沉默植株内源基因和沉默外源病毒基因的时间存在差异，植株内源基因的表达一直存在，一定时间范围内随着VIGS体系作用时间越长，沉默效率可能会越好。但是，病毒作为外源基因，其在植株内的复制表达与内源基因不同，不同种类的病毒，其基因的表达也不尽相同，因此本研究设计的时间点依据CYRSV在植株内侵染复制的特点而设计的。选择合适的侵染时间对获得 VIGS的沉默效率也至关重要，本研究通过不同接种模式下的沉默效率检测，确定了适合CYRSV病毒基因高效沉默的VIGS体系注射模式。本氏烟和辣椒中的症状及沉默效率显示，N、NSs、NSm基因沉默后，本氏烟的症状相比对照组显著减轻，而N基因沉默引起的本氏烟心叶卷曲程度最轻，病症最轻，提示我们N、NSs、NSm基因在CYSRV侵染过程中起着重要的作用，其中N基因的作用可能最显著且最重要，但仍需要进一步实验来证明这个观点。
尽管VIGS技术在植物基因功能鉴定的领域已经取得了巨大的突破，但依然面临一些不足和限制，环境因素（如光照条件、温度因子、湿度因素等）对沉默效率的影响比较大（蔡文等，2017；张琴琴等，2020）。虽然TRV介导的VIGS技术还存在不足和缺点，但其具有操作步骤简洁、载体构建简单、侵染沉默效率高、研究周期短等优点。随着VIGS技术的不断改进，相信这项技术的应用领域会越来越广，并且越来越受广大研究人员的青睐。本研究成功获得CYRSV主要功能蛋白基因N、NSs和NSm的高效VIGS体系及荧光定量PCR鉴定体系，这对了解CYRSV功能蛋白的作用、致病机制、复制策略等关键生物学特性具有重要意义。
本研究将设计的300 bp 左右的N、NSs、NSm靶片段构建到 pTRV2沉默载体上，采用先侵染注射载体2 d后再接种病毒CYRSV的顺序接种本氏烟，以及应用绝对实时荧光定量 PCR 的分析方法检测N、NSs、NSm基因的拷贝数。本研究结果发现N、NSs、NSm基因的沉默效率分别为82.07%、87.02%、94.39%，揭示了本研究构建的N、NSs、NSm的VIGS体系在本氏烟中沉默效率较高，并且先注射VIGS体系后再接种病毒的处理方法可以充分发挥VIGS体系的沉默作用，达到高效沉默基因的目的并降低病毒的侵染能力。本研究仅针对CYRSV病毒的VIGS体系构建，不同种类的病毒在植物体内复制的上升期有所不同，繁殖时间也不同，因此针对不同病毒的VIGS体系构建应探索不同接种模式。本研究成功构建了CYRSV N、NSs、NSm基因的VIGS体系，为研究N、NSs、NSm基因在病毒致病等方面的功能提供了前期材料，也为CYRSV抗病育种和田间绿色防控提供了一定的理论依据。