濒危植物山豆根全长转录组测序与不同组织比较分析
doi: 10.11931/guihaia.gxzw202508008
许丽爱 1, 2 ， 郁有健 2 ， 刘西 1 ， 潘向东 1 ， 雷祖培 1
1. 浙江乌岩岭国家级自然保护区管理中心，浙江 温州 325500
2. 浙江农林大学 园艺学院，杭州 311300
基金项目: 浙江省第二批省林业发展和资源保护项目（山豆根珍稀濒危野生植物保护）；国家自然科学基金青年项目（32202508）
Full-length transcriptome sequencing and comparative analysis different tissues in the endangered plant Euchresta japonica
XU Liai 1, 2 ， YU Youjian 2 ， LIU Xi 1 ， PAN Xiangdong 1 ， LEI Zupei 1
1. Zhejiang Wuyanling National Nature Reserve Management Center, Wenzhou 325500, Zhejiang, China
2. College of Horticulture, Zhejiang A & F University, Hangzhou 311300, China
摘要
山豆根（Euchresta japonica）是我国华南和西南地区特有的珍稀濒危豆科植物，其根部具有抗炎和抗癌等功能，但其基因组信息仍属空白。该研究通过构建其全长及比较转录组数据库，旨在为解析其分子调控网络及活性成分合成机制提供关键数据支撑。该文采用PacBio SMRT三代测序技术，对山豆根6个组织的混合样品进行全长转录组测序，并结合Illumina平台开展不同组织转录组测序，首次建立了该物种的高质量转录组资源。结果表明：（1）获得21 703个高质量Unigenes，其中99.26%（21 543个）在七大基因功能注释数据库中获得注释。（2）鉴定到1 543个转录因子，涵盖87个家族；挖掘到7 649个SSR位点，分布于6 263个Unigenes中，以混合微卫星和三碱基重复类型为主。（3）多组织比较转录组分析发现16 220个非冗余差异表达基因（DEGs），果实与花序、侧根与果实间差异最显著，花序、果实和侧根中存在大量高表达基因。（4）超过半数的黄酮类化合物合成相关基因在侧根和/或花序中高表达，与代谢物积累模式一致，表明侧根和花序是黄酮类化合物生物合成的关键场所。该研究填补了山豆根属转录组信息的空白，为解析其药用活性成分的生物合成途径、挖掘关键功能基因及开发分子标记提供了重要遗传资源。
Abstract
Euchresta japonica is a rare and endangered legume species endemic to southern and southwestern China, valued for the anti-inflammatory and anti-cancer properties of its roots. Nevertheless, genomic information for this species remains largely unavailable. This study constructed a full-length and comparative transcriptome database to provide key molecular regulatory network and the synthesis mechanism of active compounds. Using PacBio SMRT third-generation sequencing technology, this study performed full-length transcriptome sequencing on a mixed sample from six tissues of E. japonica, combined with Illumina platform for various transcriptome profiling, thereby establishing the first high-quality transcriptomic resource for this species. The results were as follows: (1) A total of 21 703 high-quality Unigenes were obtained, of which 99.26% (21 543) were annotated in seven major gene functional databases. (2) A total of 1 543 transcription factors spanning 87 families were identified, and 7 649 SSR loci were detected distributed across 6 263 Unigenes, with compound SSR and tri-nucleotide repeats being the most abundant. (3) Comparative transcriptomic analysis across six tissues revealed 16 220 non-redundant differentially expressed genes (DEGs). The most pronounced differences were observed between fruit and inflorescence, and between lateral root and fruit, with substantial numbers of highly expressed genes detected in inflorescence, fruit, and lateral root. (4) Over half of the flavonoid biosynthesis-related genes were highly expressed in lateral root and/or inflorescence, consistent with metabolite accumulation patterns, indicating that these tissues are key sites for flavonoid biosynthesis. This study provides the first comprehensive transcriptome resource for the genus Euchresta, offering valuable genetic resources for elucidating the biosynthetic pathways of bioactive compounds, identifying key functional genes, and developing molecular markers.
山豆根属（Euchresta J. Benn）是豆科（Fabaceae）中的一个小属，全球范围内共有4个物种及3个变种，包括山豆根（E. japonica）、台湾山豆根（E. formosana）、伏毛山豆根（E. horsfieldii）和管萼山豆根（E. tubulosa）及其3个变种。中国是该属的分布中心，多见于华南和西南地区，在日本、韩国和东南亚国家也有分布。李厚聪等（2014）统计发现，从山豆根属植物中已鉴定到的化学成分有153种，其中黄酮类占比最高，达86种，包括37个异黄酮和24个黄酮；此外，还有挥发油类、生物碱类和甾类等成分。该属植物均具有药用价值，药理研究表明其具有抗肿瘤、抗HIV、抗血小板聚集、中枢抑制、抗氧化、调血脂、抗菌及抗病毒等多种活性，其中黄酮类化合物可能是其主要药效成分（Lo et al., 2002, 2003; Toda & Shirataki, 2006）。
山豆根，又名胡豆莲或三小叶山豆根，在我国华南和西南地区呈零星分布（邓才富等，2008）。山豆根作为药用植物在我国的应用历史悠久，其全株均可入药，尤以根部为常用部位，具有清热、解毒、消肿和止痛等显著功效，在民间医疗实践中还用于喉癌和食道癌等恶性疾病的辅助治疗（林茂祥等，2009）。目前，山豆根的相关研究仍相对有限，现有报道大多集中在资源调查、分类学、人工培养、化学成分分析和药理学等方面（韩如刚等，2011；Choi et al., 2013；李厚聪等，2014；刘西等，2024）。我们前期的代谢组学研究证实，黄酮类化合物是山豆根的主要活性成分，在侧根和花序中表现出显著的积累特征（Xu et al., 2025）。然而，与其重要的药用价值相比，山豆根的基因组学研究仍严重滞后。目前，该属仅见伏毛山豆根核DNA标记开发和管萼山豆根叶绿体基因组的零星报道（Priyadi et al., 2018; Zhuo et al., 2021），而核基因组及全长转录组数据完全缺失。这一数据缺口严重制约了对山豆根药用成分生物合成机制的深入探索，尤其是黄酮类化合物生物合成途径的关键酶基因与调控网络尚未被系统解析。因此，开展山豆根全长转录组研究，系统阐明其次生代谢的分子基础，已成为推动该药用资源深度开发亟待解决的关键问题。
随着高通量测序技术的快速发展，基因组和转录组测序已成为解析植物基因功能的核心手段。当前的高通量测序技术根据读长差异，主要分为二代测序（next generation sequencing, NGS）和三代测序两大类型，各具特点与应用优势（沈植国等，2025）。成熟的NGS技术凭借较高性价比，广泛应用于全基因组测序和转录组分析等领域（何沛等，2020），但其较短的读长常导致后续序列拼接面临挑战。相比之下，基于单分子实时（single molecule real time, SMRT）测序原理的三代技术凭借超长读长，能够有效跨越重复序列区域，显著提升基因组组装的完整性与准确性。近年来，采用三代与二代测序相结合的混合校正策略，已成功应用于红花蜡梅（Chimonanthus praecox）（Shen et al., 2021）、向日葵列当（Orobanche cumana）与埃及列当（Phelipanche aegyptiaca）（Xu et al., 2022），以及牡丹（Paeonia suffruticosa）（冀含乐等，2024）等多种重要经济植物，为获取高质量全长转录本提供了可靠路径。
因此，获取山豆根的全长转录组数据并解析不同组织间的转录差异，将有助于揭示其药效成分积累的分子基础，也为该珍稀药用植物的资源保护与可持续利用提供关键科学依据。本研究以山豆根的主根（main root，MR）、侧根（lateral root，LR）、茎（stem，S）、叶（leaf，L）、花序（inflorescence，Inf）和果实（fruit，Fr）共6种组织为材料，采用PacBio三代测序技术进行全长转录组测序，并结合各组织二代测序数据进行联合校正，以获取高精度的全长转录组信息及全面的组织差异表达谱。通过对测序数据的系统功能注释和比较转录组分析，本研究首次构建山豆根的基因组信息资源，以期为解析其药效成分生物合成分子机制及挖掘关键功能基因奠定重要基础。
1 材料与方法
1.1 材料采集地概况
乌岩岭国家级自然保护区位于浙江省温州市泰顺县西北部，是中国距东海最近的森林生态与野生动物类型国家级自然保护区，总面积近2万hm2，森林覆盖率达92.8%，动植物资源丰富。该区属南岭闽瓯中亚热带海洋性季风气候，温暖湿润、雨量充沛，年均气温15.2 ℃，降水量2 195.8 mm，平均相对湿度在85%以上。作为飞云江（浙江第四大河）的发源地，乌岩岭的原生植被保存完整、物种丰富。
1.2 材料和处理
浙江乌岩岭国家级自然保护区内的山豆根野生种由保护区专业人员鉴定，于2017年采集种子，2018年统一育苗后，种植于该保护区上芳香保护点的科研大棚内（119°40′48.52″E、27°41′37.54″N，海拔1 050 m）。2020年5月中旬，将幼苗移栽至塑料盆中，栽培基质按草炭与珍珠岩体积比5∶1配制。2022年3月，将部分植株分批野外回归至保护区内适宜生境中。
本实验以人工栽培于该保护区的山豆根为材料，具体采样方案如下：（1）花期样品（于2023年6—7月盛花期采集大棚内栽培植株的花序）；（2）果期样品（于2023年10月结果期，选取野外回归的健康植株，采集其主根、侧根、茎、叶和果实组织）。所有样品均设4个生物学重复，每个重复取3株独立个体，取样后迅速液氮冷冻保存。
1.3 RNA提取
采用植物RNA提取试剂盒对样品进行总RNA提取，并通过多维度质量控制确保RNA质量。筛选符合以下标准的RNA样品用于后续实验：28S/18S rRNA比值≥1.8，A260/A280介于1.8至2.0之间，RNA完整性RIN值≥7.0且无明显降解迹象。
1.4 全长转录组测序
将质量合格的RNA样品按等物质的量浓度混合，按照PacBio官方标准流程构建SMRT bell文库(Wenger et al., 2019)。库检合格后使用Pacific Bioscience Sequel平台对文库进行SMRT测序。同时对各组织来源的合格RNA样品进行Illumina平台的二代转录组测序，所获数据用于三代测序数据的校正、补充及不同组织的比较转录组分析。
1.5 数据处理
获得PacBio平台的三代测序原始数据后，采用SMRTlink（v12.0.0）软件包进行数据处理。先将Polymerase Reads拆分为Subreads，再通过同一Polymerase Reads产生的Subreads进行自我纠错生成环状一致性序列（circular consensus sequence, CCS）。根据序列是否同时包含5′和3′端引物及polyA尾结构，将序列分类为全长非嵌合（full-length non-chimeric, FLNC）序列和非全长序列。随后对FLNC序列进行迭代聚类分析，获得高质量的一致性转录本序列；经转录本校正和聚类去冗余后，获得Unigene。
1.6 基因功能注释及结构分析
使用DIAMOND BLASTX（v2.0.9）软件将获得的Unigene序列与KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）、NR（http://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/FASTA/nr.gz）、GO（http://www.geneontology.org/）、KOG（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG）、Pfam（http://pfam.sanger.ac.uk/）、Swiss-Prot（https://www.expasy.org/sprot/）和TrEMBL（http://www.ebi.ac.uk/trembl/index.html）数据库比对，得到数据库注释信息；将Unigene对应的氨基酸序列使用HMMER（v3.1b2）软件与Pfam数据库比对，得到蛋白质结构域的注释结果；转录因子预测使用iTAK（http://itak.feilab.net/cgi-bin/itak/index.cgi）软件，通过hmmscan比对的方式鉴定转录因子；采用MISA（Thiel et al., 2003）对Unigene进行简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）检测，鉴定不同类型的SSR。
1.7 二代转录组数据分析步骤
对各组织来源的合格RNA样品进行Illumina平台的二代转录组测序。为了准确评估各组织中转录本的表达水平，以通过PacBio SMRT测序获得的高质量全长转录本作为参考序列。采用RSEM软件包中的bowtie2比对工具（Li & Dewey, 2011; Langmead & Salzberg, 2012），将经过严格质控的二代测序Clean Reads与三代全长转录本序列进行精确比对，从而获得可靠的转录本定量数据。为消除测序深度和基因长度对表达量计算的影响，选用FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads）作为标准化指标，该指标能准确反映每个转录本在不同组织中的相对表达水平。采用DESeq2（Love et al., 2014）软件包对样品组间进行差异表达分析，将表达量变化倍数|log2Fold Change|≥1且FDR<0.05的Unigene视为差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），并对DEGs进行GO功能注释和KEGG通路富集分析。
2 结果与分析
2.1 山豆根全长转录组测序数据统计分析
为获得山豆根的全长转录组数据，本研究基于PacBio SMRT测序平台，对山豆根的主根、侧根、茎、叶、花和果实6个组织的混合样品进行三代全长转录组测序。经数据处理，共获得14 800 380条Subreads，总计36.48 Gb，平均长度2 465 bp，N50长度为2 796 bp。通过筛选，得到271 100条环状一致性序列（CCS），243 663条全长非嵌合（FLNC）序列及27 195条一致性转录本序列（consensus transcript sequence, CTS）；进一步对高质量一致序列去冗余后，最终获得21 703条高质量的Isoforms（表1）。各序列主要分布于1 000~4 000 bp，表明文库质量良好（图1）。利用TransDecoder软件（https://github.com/TransDecoder/）对Isoforms进行CDS预测，共得到21 703个Unigenes，用于后续分析。
表 1 山豆根全长转录组测序结果概览
Table 1 Overview of full-length transcriptome sequencing results for Euchresta japonica
2.2 山豆根Unigenes的功能注释
为获得山豆根Unigenes的功能注释信息，将鉴定出的Unigenes与7个公共数据库进行比对（图2）。在21 703 个Unigenes中，共有21 543个（99.26%）至少在一个数据库中得到注释，表明测序数据完整性高、质量可靠。各数据库的注释数量分别为NR 21 520个（99.16%）、TrEMBL 21 511个（99.12%）、GO 19 796个（91.21%）、Pfam 19 563个（90.14%）、KEGG 18 455个（85.03%）、Swiss-Prot 18 262个（84.15%）及KOG 14 268个（65.74%），反映注释结果在不同功能维度上的覆盖广度。值得注意的是，有12 011个（55.34%）Unigenes在7个数据库中均得到注释（图2），构成了一个覆盖多个功能维度的核心注释基因集，为功能研究提供了宝贵的数据基础。
2.2.1 NR数据库注释
对21 520个Unigenes的NR数据库注释分析表明，这些基因序列与273个物种存在不同程度的同源性。山豆根的Unigenes与豆科植物序列相似性最高，其中与羽扇豆属的同源性最为显著。狭叶羽扇豆（Lupinus angustifolius）和白羽扇豆（L. albus）分别匹配到5 521个和4 218个Unigenes（图3），显著高于其他物种。此外，与红豆属相思子（Abrus precatorius）匹配到3 417个Unigenes，与密花豆属密花豆（Spatholobus suberectus）匹配到2 044个Unigenes，与大豆（Glycine max）和木豆（Cajanus cajan）分别匹配到879个和731个Unigenes。上述同源关系显示，山豆根在进化上与羽扇豆属植物亲缘关系最近，其次为红豆属和密花豆属植物，该结果为其分子进化和功能基因保守性研究提供了重要依据。
图 1 山豆根全长转录组测序关键数据集的长度分布
Fig. 1 Length distribution of key datasets in the full-length transcriptome sequencing of Euchresta japonica
2.2.2 GO功能分类
通过对19 796个Unigenes进行GO功能注释，共将其归类至生物过程、细胞组分和分子功能三大本体类别下的45个功能组（图4）。在生物过程的22个功能组中，细胞过程（14 388个）和代谢过程（12 249个）注释的Unigenes较多，体现了其基础生命活动的活跃性；其次为刺激响应（6 404个）、生物调控（6 120个）和生物进程调控（5 676个）等功能组，反映了山豆根对环境适应的分子基础。细胞组分仅包含细胞解剖结构（17 423个）和蛋白质复合物（3 609个）两类。分子功能以结合活性（12 677个）和催化活性（10 026个）为主，符合其次生代谢产物合成的功能需求。此外，转运蛋白活性（1 624个）、ATP依赖性活性（1 528个）和转录调控因子活性（1 159个）等虽然注释数量较少，但对理解药用成分转运、能量代谢和基因表达调控具有重要价值。系统的GO注释为解析山豆根的分子功能和代谢特征提供了坚实基础。
2.2.3 KOG功能分类
基于KOG数据库的功能注释分析显示，山豆根转录组中共有14 268个Unigenes被归类到25个功能类群（图5）。其中，注释为仅一般功能预测的Unigenes数量最多（2 526个，17.7%），与蛋白质加工相关的功能类群翻译后修饰、蛋白质周转与分子伴侣（1 675个，11.7%）和信号转导机制（1 602个，11.2%）也具有较高的注释频率。代谢相关类群中，碳水化合物转运与代谢（952个，6.7%）占比最高，其次为次生代谢物合成、转运与分解及能量产生与转换（均为620个，4.3%）、氨基酸转运与代谢（596个，4.2%）和脂质转运与代谢（594个，4.2%）。尽管占比较低，但这些代谢相关基因可能与其独特药用价值密切相关，尤其是次生代谢物合成相关基因为解析其活性成分的生物合成提供了重要线索。此外，核苷酸转运与代谢（148个，1.0%）和辅酶转运与代谢（122个，0.8%）等基础代谢类群的注释，也为理解其整体代谢网络提供了依据。KOG注释结果系统揭示了山豆根基因功能的多样性，为深入研究其药用成分合成机制提供了方向。
图 2 基于7个功能注释数据库的Unigenes注释情况统计
Fig. 2 Statistics of Unigenes annotating based on seven functional annotation databases
2.2.4 KEGG代谢途径分析
KEGG分析显示，山豆根转录组中共有18 455个Unigenes获得功能注释，其中10 073个Unigenes被定位到KEGG代谢通路中，主要富集于代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程和有机体系统五大类别下的145个代谢通路，涵盖22个亚类（图6）。代谢类别注释基因数量最多，覆盖了从基础代谢到次生代谢的11个亚类，包括全局及概览图谱、碳水化合物代谢、氨基酸代谢和脂质代谢等核心代谢途径。值得注意的是，在与药用价值相关的次生代谢通路（如萜类与聚酮化合物代谢）中注释到大量Unigenes，为解析山豆根药用活性成分的生物合成提供了重要线索。遗传信息处理类别包含蛋白质折叠、分选与降解等6个亚类。细胞过程类别的Unigenes则富集在转运与分解代谢和细胞运动2个亚类，而有机体系统类别的Unigenes则特异性地富集在环境适应亚类，可能与山豆根自然生境适应策略有关。
图 3 基于NR数据库的物种同源基因比对数量统计
Fig. 3 Statistical number of homologous gene alignment of species based on the NR database
山豆根转录组在145个代谢通路中均有基因注释（表2）。其中，代谢途径（ko01100）以4 096个Unigenes（40.66%）的注释量居首，表明其基础代谢活跃。其次为次生代谢物生物合成通路（ko01110，2 204个，21.88%）。此外，本研究还鉴定出多个与药用成分合成直接相关的通路，包括苯丙烷类生物合成（ko00940）、异黄酮生物合成（ko00943）和黄酮类生物合成（ko00941）。植物激素信号转导（ko04075，667个）和植物-病原体互作（ko04626，635个）等防御相关通路也有大量基因注释，可能与其野外适应性有关。初级代谢方面，碳代谢通路（ko01200，582个）的注释提示了其能量代谢的基础特征。以上结果为解析山豆根特征性药用成分的生物合成机制提供了重要分子依据。
图 4 Unigenes的GO功能分类注释结果
Fig. 4 Annotation results of Unigenes based on the GO function classification
2.3 转录因子分析
转录因子预测分析共鉴定出1 543个具有转录因子功能的Unigenes，涵盖了87个家族（图7）。其中，C3H型锌指蛋白家族成员最多（102个），其次为B3-ARF家族（67个）、C2H2锌指蛋白家族（65个）、GRAS家族（61个）、FAR1家族（60个）和bHLH家族（59个）。这些转录因子家族协同作用，共同构成了山豆根特有的基因表达调控体系。
图 5 基于KOG数据库的Unigenes功能注释分类统计
Fig. 5 Functional annotation and classification statistics of Unigenes based on the KOG database
图 6 KEGG通路分类
Fig. 6 KEGG pathway classification
2.4 山豆根Unigenes简单重复序列（SSR）
对21 703个Unigenes进行SSR分析，共鉴定出7 649个SSR位点，分布于6 263个Unigenes中（图8），其中1 172个Unigenes含有多个SSR位点。对SSR的类型和数量进行分析，发现SSR种类及数量极为丰富且各种类型的出现频率也有较大差异。共鉴定出7种类型，包括单碱基重复（mono-nucleotide，Mono）、双碱基重复（di-nucleotide，Di）、三碱基重复（tri-nucleotide，Tri）、四碱基重复（tetra-nucleotide，Tetra）、五碱基重复（penta-nucleotide，Penta）、六碱基重复（hexa-nucleotide，Hexa）和混合简单重复序列（compound SSR，C-SSR）。其中，C-SSR数量最多（2 251个，29.43%），其次为三碱基重复（Tri）（2 097个，27.42%）且以AAG/CTT、GAA/TTG和TCT/AGA为主。单碱基重复（Mono）共有1 822个（23.82%），以A/T为主（1 802个，98.90%）；双碱基重复（Di）共有1 206个（15.77%），以TC/AG和TC/GA为主（图8：A）。这些结果为进一步开发山豆根分子标记提供了重要依据。
2.5 山豆根不同组织差异表达基因统计比较分析
基于筛选标准（|log2Fold Change|≥1且FDR<0.05），对山豆根6个组织间的15组两两比较进行了分析，共鉴定出16 220个非冗余的DEGs（图9），显示出明显的组织间转录组异质性。其中，果实与花序（Fr_vs_Inf）比较组的差异最显著，共检测到9 481个DEGs，表明两者在发育过程中可能涉及不同的基因调控机制；其次是侧根与果实（LR_vs_Fr）比较组，共鉴定出9 352个DEGs，暗示根系与生殖器官间存在深层次的分子差异；其他比较组也呈现出不同程度的转录差异（图9）。
表 2 山豆根KEGG数据库注释基因数量最多的20条通路
Table 2 Top 20 KEGG pathways with the highest gene annotation counts in Euchresta japonica
韦恩图分析结果（图10）显示，涉及花序的5个比较组（Fr_vs_Inf、MR_vs_Inf、LR_vs_Inf、Inf_vs_L、Inf_vs_S）共有775个DEGs，其次是涉及果实的5个比较组（共有747个），均明显多于其他组织（共有均少于250个），说明花序和果实可能各有一套核心调控基因。热图分析结果（图11）进一步表明，花序、果实和侧根中存在大量显著高表达的DEGs。这些结果系统揭示了山豆根组织特异性的转录调控特征，为深入研究其功能基因提供了关键线索。
图 7 Unigenes注释转录因子的家族分类分析
Fig. 7 Classification analysis of transcription factor families annotated from Unigenes
2.6 黄酮类化合物生物合成代谢途径相关基因在侧根和花序中高表达
前期代谢组学研究显示，山豆根的主要活性成分是黄酮类化合物且在侧根和花序中显著富集（Xu et al., 2025）。为阐明这一组织特异性积累的分子机制，本研究系统分析了黄酮生物合成（ko00941）和异黄酮生物合成（ko00943）途径的基因表达模式。共鉴定到63个黄酮生物合成相关基因和65个异黄酮生物合成相关基因。热图分析结果（图12）表明，这些基因在侧根和花序中呈现明显高表达趋势，其中42个黄酮合成相关基因和33个异黄酮合成相关基因在侧根和/或花序中高表达。值得注意的是，查尔酮合成酶（chalcone synthase, CHS）作为黄酮类化合物生物合成途径中的第一个关键酶，其13个编码基因中有5个在侧根中高表达（Transcript_22722、Transcript_23034、Transcript_23076、Transcript_23456、Transcript_23747），6个在花序中高表达（Transcript_19931、Transcript_21026、Transcript_21834、Transcript_22940、Transcript_23952、Transcript_25354）。该表达模式与代谢组中黄酮类化合物的组织积累分布高度一致，从转录水平证实了黄酮与异黄酮类成分主要积累于侧根和花序。这一发现不仅揭示了山豆根药用活性成分组织特异性积累的转录调控基础，也为有效成分的定向调控提供了候选基因资源。
3 讨论与结论
基因组测序技术的革新极大地推动了植物重要性状遗传机制的解析（刘雄盛等 2023；何斌等，2025）。在从Sanger测序向高通量测序发展的过程中，二代测序凭借其高通量、低成本的优势成为主流，但其短读长限制了在复杂基因组解析中的应用（罗纯等，2015）。近年来，以PacBio SMRT和Oxford Nanopore为代表的第三代测序技术通过单分子实时测序实现了10~100 kb的超长读长（Angers et al., 2021），不仅有效克服了短读长的局限，还能直接检测碱基修饰。尽管三代技术存在一定的原始错误率，但基于环形一致性测序和生物信息学校正，数据质量已显著提升，使得三代与二代测序技术联用成为当前植物基因组研究的重要策略（Sun et al., 2022）。
本研究采用PacBio SMRT结合NGS混合测序策略，首次获得山豆根属植物山豆根21 703个高质量的Unigenes，功能注释率高达99.26%。其中，55.34%的Unigenes在7个数据库中均获得注释。这些注释基因填补了山豆根基因数据库资源的空白，为后续功能研究奠定了基础。值得注意的是，在缺乏近缘物种参考基因组的情况下，山豆根与羽扇豆属物种显示出较高序列相似性，这一现象与马鞭草（Verbena officinalis）（黄丽容等，2023）、滇重楼（Paris polyphylla）（徐萍等，2024）和滇龙胆草（Gentiana rigescens）（谢宗怡等，2025）等研究的发现一致，即所研究物种与同科非同属植物序列相似性最高。这既反映了当前药用植物基因组数据的匮乏，也凸显了加强物种特异性遗传信息挖掘的迫切需求。转录因子预测分析表明，山豆根中存在丰富的C3H型锌指蛋白转录因子家族成员，该家族在植物逆境响应中具有重要作用。有研究表明，C3H家族成员广泛参与低温、盐碱、干旱及氧化胁迫等多种环境胁迫的应答过程（Han & Qiao, 2021; Wang et al., 2022）。这一发现提示C3H家族可能主导着山豆根适应环境变化和维持生长发育的核心调控网络，并为解析其抗逆分子机制提供了关键候选调控因子。此外，B3-ARF和bHLH等转录因子家族的富集，也表明山豆根可能具备复杂的激素信号和次生代谢调控系统（罗光宇等，2013；安昌等，2023）。SSR位点广泛分布于真核生物基因组中，利用SMRT测序获得的全长转录本开发SSR标记是一种高效可行的方法（王娟娟等，2016；刘雄盛等，2023）。本研究共鉴定出7 649个SSRs位点，分布于6 263个Unigenes上。混合简单重复序列、三碱基、单碱基和双碱基重复为主要类型，均占比15%以上，合计超过总数的96%，为山豆根属植物分子标记开发提供了丰富的遗传标记资源。
图 8 SSR分析结果统计
Fig. 8 Statistical results of SSR analysis
图 9 山豆根6个组织共15个比较组间的差异表达基因数量统计
Fig. 9 Statistical number of DEGs among 15 pairwise comparison groups across six tissues of Euchresta japonica
次生代谢产物是植物药用活性的物质基础，其合成、积累和调控机制的研究对中医药现代化及创新药物研发具有重要意义。黄酮类化合物作为多种中药的主要有效成分，广泛分布于豆科、芸香科、蔷薇科和菊科等药用植物中，具有抗氧化、清除自由基和抗菌等多种药理活性（张恒等，2023）。山豆根属植物主要含黄酮类、挥发油类、生物碱类、少量的甾类及木酚素等成分（李厚聪等，2014；Li et al., 2019a, b）。该属植物提取物具有广泛的药理活性。台湾山豆根的乙醇提取物可抑制人肝癌细胞Hep3B的增殖和转移，并诱发细胞凋亡（Hsu et al., 2007a, b）；其多种黄酮类化合物对多种癌细胞具有细胞毒作用，并能抑制HIV病毒的复制及血小板凝集（Lo et al., 2002, 2003）；山豆根某黄酮类化合物（5, 7, 4′-trihydroxy-6, 8-diprenylisoflavone）具显著抗氧化能力（Toda & Shirataki, 2006），部分黄酮类化合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和热带念珠菌表现出较强抗菌活性（Mizuno et al., 1988）。由此可见，黄酮类化合物是该属植物主要的药用活性成分。前期代谢组学研究进一步证实，山豆根中黄酮类（占29.81%）与酚酸类（13.08%）代谢物占比最高，其中305种具关键药理活性，364种与重大疾病防治相关，并且黄酮与异黄酮合成通路被确定为药用价值形成的关键代谢枢纽（Xu et al., 2025）。转录组学分析为解析药用植物药效活性成分的生物合成机制提供了关键技术支持（严志祥等，2019；祁增兴等，2022；蔡允璋和贾巧君，2025）。本研究KEGG分析显示，苯丙烷类生物合成（ko00940）、异黄酮生物合成（ko00943）和黄酮类生物合成（ko00941）通路均注释到大量基因。比较转录组进一步揭示，山豆根不同组织间存在显著的转录差异且果实与花序、侧根与果实之间差异最为显著，暗示这些组织可能涉及不同的基因调控网络。值得注意的是，黄酮类化合物生物合成相关基因（如多个查尔酮合成酶编码基因）在侧根和花序中显著高表达，与前期代谢组学研究中这两个组织内黄酮类成分的高积累现象高度一致(Xu et al., 2025)。这种基因表达与代谢物积累的一致性，不仅从分子层面证实了山豆根药用活性成分的组织特异性分布机制，也为后续开展活性成分定向调控和功能基因研究提供了关键靶点。
图 10 山豆根不同组织DEGs的韦恩图分析
Fig. 10 Venn diagram analysis of DEGs in different tissues of Euchresta japonica
本研究整合PacBio SMRT三代测序和二代测序技术，成功构建了高质量的山豆根全长转录组数据和多组织转录组数据库。该数据集填补了山豆根属植物基因组信息的空白，为解析其药用活性成分的生物合成途径、挖掘关键功能基因及开展分子育种研究奠定了可靠基础。本研究成果将有力促进山豆根药用资源的深度开发与可持续利用。
图 11 山豆根不同组织DEGs的热图分析
Fig. 11 Heatmap analysis of DEGs in different tissues of Euchresta japonica
图 12 山豆根黄酮(A)和异黄酮(B)的生物合成相关基因的表达模式分析
Fig. 12 Expression pattern analysis of flavonoid (A) and isoflavonoid (B) biosynthesis-related genes in Euchresta japonica
图 1 山豆根全长转录组测序关键数据集的长度分布
Fig. 1 Length distribution of key datasets in the full-length transcriptome sequencing of Euchresta japonica
图 2 基于7个功能注释数据库的Unigenes注释情况统计
Fig. 2 Statistics of Unigenes annotating based on seven functional annotation databases
图 3 基于NR数据库的物种同源基因比对数量统计
Fig. 3 Statistical number of homologous gene alignment of species based on the NR database
图 4 Unigenes的GO功能分类注释结果
Fig. 4 Annotation results of Unigenes based on the GO function classification
图 5 基于KOG数据库的Unigenes功能注释分类统计
Fig. 5 Functional annotation and classification statistics of Unigenes based on the KOG database
图 6 KEGG通路分类
Fig. 6 KEGG pathway classification
图 7 Unigenes注释转录因子的家族分类分析
Fig. 7 Classification analysis of transcription factor families annotated from Unigenes
图 8 SSR分析结果统计
Fig. 8 Statistical results of SSR analysis
图 9 山豆根6个组织共15个比较组间的差异表达基因数量统计
Fig. 9 Statistical number of DEGs among 15 pairwise comparison groups across six tissues of Euchresta japonica
图 10 山豆根不同组织DEGs的韦恩图分析
Fig. 10 Venn diagram analysis of DEGs in different tissues of Euchresta japonica
图 11 山豆根不同组织DEGs的热图分析
Fig. 11 Heatmap analysis of DEGs in different tissues of Euchresta japonica
图 12 山豆根黄酮(A)和异黄酮(B)的生物合成相关基因的表达模式分析
Fig. 12 Expression pattern analysis of flavonoid (A) and isoflavonoid (B) biosynthesis-related genes in Euchresta japonica
表 1 山豆根全长转录组测序结果概览
Table 1 Overview of full-length transcriptome sequencing results for Euchresta japonica
表 2 山豆根KEGG数据库注释基因数量最多的20条通路
Table 2 Top 20 KEGG pathways with the highest gene annotation counts in Euchresta japonica
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