摘要
为研究樟属3种柠檬醛型树种内生真菌群落多样性，探究相同型不同树种及不同组织部位内生真菌的多样性、结构差异，该文通过高通量测序的方法分析了36个样本，共获得序列2 207 878条。结果表明：（1）樟属柠檬醛化学型不同树种的内生真菌群落在物种组成上差异显著，并且内生真菌物种组成在根、茎、叶中展现出器官偏好性和多样性。（2）Chao和Ace指数的排序一致，均为樟（Camphora officinarum）（QCA）>猴樟（C. bodinieri）（QBO）>黄樟（C. parthenoxylon）（QPO），表明樟的内生真菌物种丰富度最高，其OTU数量为690；黄樟的物种丰富度最低，OTU数量为414。Shannon多样性指数的排序为QPO>QBO>QCA，Simpson多样性指数则与之相反，表明樟的内生真菌群落多样性最小。（3）Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）表明，猴樟和黄樟的样本点聚集紧密，表明二者的内生真菌群落结构相似度较高；而这两种植物与樟的样本点分布相对分散，因此它们与樟的内生真菌群落结构相似度较低。（4）樟属3种柠檬醛型树种均表现为叶和茎内生真菌的群落结构相似，但根与叶的内生真菌的群落差异较大。该结果表明宿主树种与组织部位异质性的共同作用塑造了内生真菌群落，不仅为筛选樟属柠檬醛型树种中具有潜在功能的内生真菌奠定了基础，也为内生真菌群落与宿主树种及化学型的协同进化关系提供了参考。
Abstract
To investigate the community diversity of endophytic fungi in three citral chemotype tree species in Camphora, and to explore the diversity and structural differences of endophytic fungi in different tree species with the same chemotype and various tissue parts, this study analyzed 36 samples by high-throughput sequencing method, and a total of 2 207 878 sequences were obtained. The results were as follows: (1) The endophytic fungal communities of different tree species with the citral chemotype in Camphora exhibited significant differences in species composition, and the endophytic fungal species composition showed organ preference and diversity in roots, stems, and leaves. (2) The ranking of the Chao and Ace indices was consistent, both showing Camphora officinarum (QCA) > C. bodinieri (QBO) > C. parthenoxylon (QPO), indicating that C. officinarum had the highest species richness of endophytic fungi, with 690 OTUs, while C. parthenoxylon had the lowest species richness, with 414 OTUs. In contrast, the Shannon diversity index showed the order QPO > QBO > QCA, and the Simpson diversity index exhibited the opposite trend. Thus, it could be concluded that the endophytic fungal community diversity of C. officinarum was the lowest. (3) Principal coordinate analysis (PCoA) based on Bray-Curtis distances revealed that the sample points of C. bodinieri and C. parthenoxylon were closely clustered, indicating a high similarity in their endophytic fungal community structures. In comparison, the sample points of these two species were relatively dispersed from those of C. officinarum, suggesting a lower similarity in endophytic fungal community structure between them and C. officinarum. (4) The three citral chemotype tree species of Camphora all exhibited similar community structures of endophytic fungi in leaves and stems, but showed significant differences in the fungal communities between roots and leaves. The results indicate that the combined influence of host tree species and tissue heterogeneity shapes the endophytic fungal community, laying a foundation for exploring potential functional endophytic fungi in citral chemotype tree species of Camphora and provide insights into the co-evolutionary relationship between endophytic fungal communities and host tree species and chemotypes.
樟属（Camphora）植物是重要的经济林木，其中部分树种因富含特定萜类化合物而被划分为不同的化学型，根据其所含特征性萜类化合物的差异，可划分为多种化学型，如樟脑型、芳樟醇型和柠檬醛型等（郑永杰，2022）。柠檬醛是一种含香叶醛和橙花醛两种同分异构体的单萜醛类化合物（Ling et al., 2022），是樟属的一种化学型，也是合成维生素A、维生素E和紫罗兰酮的关键原料，广泛应用于医药、食品、香精香料等领域(Thielmann & Muranyi, 2019；向育君等，2020)。
内生真菌（endophytic fungi)是指在其生活史的一定或全部阶段生活于健康植物各种组织或细胞间隙且不引起明显疾病症状的真菌，其与宿主植物通过长期的协同进化形成了独特的互惠共生关系（Gakuubi et al., 2021）。它们经长期协同进化广泛分布于植物各器官，其种类、数量和分布特征均因植物种类而异(郭顺星，2018）。尽管植物内生真菌群落结构及其与宿主关系的差异性研究已较多，但目前主要聚焦于木本植物的不同树种（Sun et al., 2012；Li et al., 2016；钱海源等，2018）及相同树种不同季节（Elmagzob et al., 2019）、不同地区（Fang et al., 2019；杨娟等，2019；周思旋等，2023）或不同组织部位（顾美英等，2022；Li et al., 2023）。近年来的研究表明，内生真菌能够参与或调控植物萜类等次生代谢产物的合成（Keller, 2019；毛欣颖等，2025）；同一树种不同化学型的内生真菌群落结构也具有明显的差异性（吕立新等，2014）；植物内生真菌群落结构的差异既存在于不同宿主间，也存在于同一宿主的不同组织间（王涛等，2009）；即使宿主植物相同，也会因不同组织中活性物质的组成和生态位的差异而显示出组织特异性（王营等，2017）。因此，揭示相同化学型树种的内生真菌群落的组成与多样性，对于理解相同化学型下不同树种间菌群的共性与特异性、组织部位的分化规律及其与化学型代谢的潜在关联具有重要的理论和应用价值。
本研究以樟属3种柠檬醛型树种内生真菌群落为研究对象，采用高通量测序技术，系统分析其内生真菌群落的组成、多样性和结构差异，拟探讨以下问题：（1）相同化学型不同樟属树种的内生真菌群落差异；（2）樟属3种柠檬醛型树种内生真菌群落的物种多样性特征及其优势类群的生态分布规律；（3）这些特征是否暗示内生真菌群落在宿主柠檬醛生物合成与维持中发挥着潜在的功能性作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料和取样方法
试验材料取自江西省樟树繁育与开发利用产业技术工程化中心樟树优良无性系采穗圃（江西省南昌市，116°03′28″E、28°41′55″N），选用3种柠檬醛型樟属优良无性系8年生扦插苗，分别为猴樟（Camphora bodinieri QBO）、黄樟（C. parthenoxylon，QPO）、樟（C. officinarum，QCA）。2024年10月，在统一生境条件下，针对3种目标树种，每种随机选取4株长势均一的健康植株作为生物学重复，对每株植株，分别采集无损伤的成熟叶片、当年生健壮新枝及健康细根，共36个样本，采样工具经75%酒精消毒并灼烧灭菌，样本用无菌自封袋标记，样本编号及宿主信息如表1所示。采集样本后立即置于保温箱内(内含冰袋)运回实验室，用于内生真菌DNA提取。
表
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樟属3种柠檬醛型树种信息及样本编号
Table
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Information of three citral chemotype tree species of Camphora and sample numbers
1.2 样本DNA提取和PCR扩增
1.2.1 样本表面消毒和DNA提取
参照宋培勇等（2011）的方法，对樟属3种柠檬醛型树种的根、茎、叶进行表面消毒，步骤如下：无菌水漂洗30 s→75%乙醇浸泡1 min→2%NaClO溶液浸泡3 min→75%乙醇浸泡1 min→无菌水漂洗30 s。消毒完成后，采用植物基因组DNA提取试剂盒（林雪玲等，2019）提取DNA，操作按试剂盒说明书进行。
1.2.2 PCR扩增及测序
PCR(王荣谈等2009)采用 TransGen AP221-02: TransStart Fastpfu DNA Polymerase引物为 ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAA GTAA) 和 ITS2R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC) 扩增片段为 ITS1F_ITS2R 区每个样本设 4 个重复反应 PCR 产物经混合后通过 2%琼脂糖凝胶电泳验证。目标条带使用 AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒(AXYGEN 公司) 进行目的片段切胶回收以Tris_HCl 缓冲液洗脱ꎬ并再次电泳验证合格的PCR产物委托上海美吉生物医药科技有限公司（www.majorbio.com），利用Illumina Hiseq平台进行高通量测序。所得数据在I-Sanger生物信息分析云平台（http://www.i-sanger.com/）完成数据处理和生物多样性分析。
1.3 数据处理
原始测序数据经质控过滤后，使用QIIME软件按97%相似度水平下进行操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）聚类。OTU通过与UNITE等数据库进行比对完成物种注释。采用Shannon、Simpson、Chao和Ace指数分析样本内生真菌群落的α多样性。通过主坐标分析（PCoA）比较不同样本间内生真菌群落结构的差异。利用Kruskal-Wallis秩和检验分析不同树种及组织间物种相对丰度的显著差异，以筛选出具有组间差异的内生真菌类群。
2 结果与分析
2.1 序列的有效数据
在樟属3种柠檬醛型树种的根、茎和叶共36个样品中，通过测序获得2 207 878条序列；碱基数为575 011 267，平均长度为249.990 302 472 bp，最短序列长度为142 bp，最长序列长度为538 bp，序列平均长度为340 bp。由图1可知，Simpson与Shannon指数的稀释曲线均趋于平坦，表明测序数据量合理可靠，能充分反映样本内生真菌多样性信息。
图
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樟属3种柠檬醛型树种的真菌稀释曲线
Fig.
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Dilution curves of fungi from three citral chemotype tree species in Camphora
2.2 不同树种及不同组织部位OTU数量
由图2可知，从樟属3种柠檬醛型树种猴樟（QBO）、黄樟（QPO）和樟（QCA）的茎、叶和根的36个样本中共检测出1 238个OTUs。由图2：A可知，猴樟的OTU数量为605，樟的OTU数量为690，黄樟的OTU数量为414；猴樟和樟共有的OTU数量最多，为156，而樟和黄樟的共有OTU数量仅为32，猴樟和黄樟的共有OTU数量为57；猴樟、黄樟和樟三者共有的OTU数量为113，共有数量占全部检测真菌分类单元的9.13%。由表2可知，基于OTU组成的共有属有酵母属（Saccharomyces）、枝孢属（Cladosporium）、孢子菌属（Codinaea）等10种及一些分类不明确的属。猴樟中独有OTU的数量为279，黄樟中独有OTU的数量为212，樟中独有OTU的数量为389；樟中独有OTU的数量最多，占比31.42%。这表明不同柠檬醛型樟属树种的内生真菌群落丰富度和多样性间存在差异。
图
2
樟属3种柠檬醛型树种及组织中的OTUs数量Venn图
Fig.
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Venn diagram of number for OTUs in tissues of three citral chemotype tree species in Camphora
表
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樟属3种柠檬醛型树种及不同组织部位共有属
Table
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Shared genera among three citral chemotype tree species in Camphora and their different tissues
3个树种的不同组织部位OTU数量也存在差异。由图2：B可知，从叶中检测到OTU数量最多的是樟，其次是猴樟，黄樟最少，共有OTU数量为43，基于OTU组成的共有属有酵母属、枝孢属、镰孢属（Fusarium）等8种及一些分类不明确的属。由图2：C可知，从茎中检测到OTU数量最多的是猴樟，其次是黄樟，樟最少，共有OTU数量为22，基于OTU组成的共有属有嗜热丝孢菌属（Thermomyces）、枝孢属、链格孢属（Alternaria）等3种及一些分类不明确的属。由图2：D可知，从根中检测到OTU数量最多的是樟，其次是猴樟，黄樟最少，共有OTU数量为23，基于OTU组成的共有属有孢子菌属、篮状菌属（Talaromyces）、暗枝顶孢属（Phaeoacremonium）等8种及一些分类不明确的属。这表明在樟属3种柠檬醛型树种中，叶和根的内生真菌OTU数量的顺序一致，但其菌群存在差异，说明叶和根两个组织部位微生物群落丰富度具有相似的物种选择模式，而茎组织可能存在独特的物种选择模式。
2.3 内生真菌群落结构
由图3可知，有效鉴定的前10的门依次是子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、被孢霉门（Mortierellomycota）、壶菌门(Chytridiomycota)、球囊菌门（Glomeromycota）、油壶菌门（Olpidiomycota）、罗兹菌门（Rozellomycota）、Entorrhizomycota、捕虫霉门（Zoopagomycota）、芽枝霉门（Blastocladiomycota）、毛霉门（Mucoromycota）。其中，子囊菌门为绝大多数样本的核心优势菌群，相对丰度超过60%，说明樟属不同树种的内生真菌在门水平上具有显著的共性。这可能与樟属植物亲缘关系较近、共享相似的生理代谢特征有关，这些共同特征为子囊菌门真菌提供了适宜的生存环境，使其成为优势类群。然而，有5个样本与其他样本组成存在差异性，猴樟中G3样本的优势菌群是担子菌门，与多数样本不同，可能与该样本的生长环境或个体差异有关；猴樟J3和Y1样本中未分类的菌门占比较高，暗示猴樟部分个体可能存在独特的内生真菌类群。樟J1、J2和J3样本中也是未分类的菌门占比较高，而黄樟的优势菌群均为子囊菌门，樟与猴樟的部分样本类似，但与黄樟和多数样本差异显著，说明樟的内生真菌群落可能包含更多未被鉴定的类群，其宿主茎部更易富集这些未知菌门。图4显示了樟属3种柠檬醛型树种在属水平的内生真菌相对丰度占比前15的属，发现除嗜热丝孢菌属（Thermomyces）和被孢霉属（Mortierella）以外的其他13个属均属于子囊菌门。樟属3种柠檬醛型树种均出现子囊菌富集现象，揭示了子囊菌可能具有普遍的适应性和生态优势。
图
3
门水平上真菌的丰度占比
Fig.
3
Fungal abundance proportion at phylum level
图
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属水平上真菌的丰度占比
Fig.
4
Fungal abundance proportion at genus level
2.4 α多样性分析
采用Shannon指数、Simpson指数、Chao和Ace指数对樟属3种柠檬醛型树种的根、茎和叶内生真菌的α多样性进行评价，结果见图5，图中的缩写分别代表一组样品。Shannon指数和Simpson指数均用于表示群落多样性，Chao和Ace指数用于量化物种丰富度。Shannon指数越高，表明样品内生真菌群落多样性越丰富；而Simpson指数越高，则反映其多样性越低。由图5可知，Shannon多样性指数从高到低的顺序为黄樟>猴樟>樟；Simpson多样性指数从高到低的顺序为樟>猴樟>黄樟，表明黄樟的内生真菌群落多样性最丰富，樟最低。Chao和Ace指数从高到低的顺序均为樟>猴樟>黄樟，表明樟的内生真菌物种丰富度最高，黄樟的内生真菌物种丰富度最低。樟的物种丰富度最高，但群落多样性较小，说明该群落中少数物种占绝对优势，造成内生真菌群落多样性降低。
图
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樟属3种柠檬醛型树种的α多样性指数
Fig.
5
α-diversity indices of three citral chemotype tree species in Camphora
2.5 β多样性分析
在OTU水平上，基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）对樟属3种柠檬醛型树种的36个样本进行分析，比较不同树种及不同组织部位内生真菌群落结构的差异（图6）。在树种层面（图6：A），PC1和PC2轴贡献率分别为13.38%和11.05%（累积24.43%）。猴樟与黄樟样本点聚集紧密，而二者与樟样本点相对分散，表明猴樟和黄樟的群落结构相似度较高，而二者与樟的相似度较低。在植物组织部位层面（图6：B），叶和茎的样本点聚集紧密，根则与叶相距较远，表明叶与茎的群落结构相似度较高，而根与叶的相似度较低。茎和根有部分样本点密集，说明两者具有相似性，可能因为相近组织部位之间存在一定的相似性。
图
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不同树种（A）和不同组织部位（B）的β多样性分析PCoA散点图
Fig.
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PCoA scatter plots of β-diversity analysis for different tree species (A) and tissues (B)
2.6 物种差异分析
通过Kruskal-Wallis秩和检验对樟属3种柠檬醛型树种样品和不同组织部位之间进行统计，结果见图7。Epicoleosporium是3种树种中差异极显著的菌群（𝑃<0.001）；弯孢属（Curvularia）是3种树种中差异较显著的菌群（𝑃<0.01）；Pseudoveronaea、指赤壳属（Dactylonectria）、毛壳菌属（Trichomerium）、梭孢菌属（Fusicolla）、Pallidocercospora和肉座菌目分类地位未定类群（Hypocreales_gen_Incertae_sedis）是3种树种中差异显著的菌群（𝑃<0.05）。枝孢属、孢子菌属（Codinaea）和篮状菌属是不同组织部位中差异极显著的菌群（𝑃<0.001）；曲霉属（Aspergillus）和假丝酵母属（Candida）是不同组织部位中差异较显著的菌群；黑孢属（Nigrospora）、球囊菌门未定属（Glomeromycota_gen_Incertae_sedis）、暗枝顶孢属（Phaeoacremonium）、鳞斑霉属（Malassezia）和丝核菌属（Rhizoctonia）是不同组织部位中差异显著的菌群。综上表明，同一化学型的不同树种之间和不同组织部位之间均存在明显的差异菌群。
图
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物种比较条形图
Fig.
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Species comparison bar chart
3 讨论与结论
3.1 相同化学型不同樟属树种的内生真菌群落差异
本研究通过对樟属3种柠檬醛型树种根、茎、叶内生真菌群落的分析，发现尽管宿主植物同一化学型，但其内生真菌群落结构在门水平和属水平均存在显著性差异。子囊菌门在绝大多数样本中占绝对优势（相对丰度>60%），印证了其作为樟属植物核心内生真菌群落的地位。然而，猴樟（G3样本）中担子菌门成为最优势类群，以及猴樟（J3、Y1）和樟（J1-J3）样本中未分类真菌门的高占比，表明在相同的化学型背景下，宿主树种身份仍是驱动内生真菌群落分化的关键因素。刘雯雯等（2024）的研究结果表明油樟叶片的优势内生真菌是子囊菌门，与本研究结果一致。樟属树种同属一科，亲缘关系近，因此共享子囊菌门和担子菌门这一核心优势类群，体现了宿主系统发育关系对内生真菌群落的基础影响。部分样本优势菌群不一样，可能出现树种特异性分化，黄樟的单一优势类群、樟和猴樟中未分类菌门的高占比，反映了不同树种在长期演化中形成了独特的内生真菌互作机制，可能与各自的生态适应性有关。猴樟和樟的不同样本间存在差异，说明即使同一树种，内生真菌群落也可能因个体生长环境而分化，环境筛选作用叠加在宿主特异性之上。
Kruskal-Wallis秩和检验可以解决样本间是否存在显著性差异(Johnson, 2022)。Kruskal-Wallis秩和检验鉴定出多个在树种间差异极显著和差异较显著的菌属，如Epicoleosporium（𝑃<0.001）和弯孢属（𝑃<0.01）。这与潘虹等（2023）的研究结论相一致，即树种差异极显著地影响真菌群落的β多样性且不同树种对真菌类群的富集作用存在差异。魏安琪等（2019）研究发现，不同植被类型土壤微生物群落结构存在差异。本研究进一步证实，即使在同一化学型下，不同樟属树种仍存在显著差异的内生真菌群落结构。此外，本研究还发现不同组织部位间也存在显著差异菌群，如枝孢属、孢子菌属和篮状菌属在不同部位中差异极显著（𝑃<0.001），进一步支持了微生境对真菌定殖的选择性压力。同一化学型不同树种存在特异性的菌群组成，不同器官也具有独特的菌群结构，表明内生真菌群落与宿主化学型及组织微环境之间存在深层次的互作关系。这种互作可能涉及宿主代谢产物的特异性诱导、生态位适应及功能协同等多种机制，值得进一步研究。
3.2 物种多样性特征及其优势类群的生态分布规律
植物内生真菌群落多样性受组织部位、温度、季节及生长年份等因素影响（Gopi & Jayaprakashvel, 2017）。本研究β多样性分析表明，叶与茎的内生真菌群落结构相似度较高，而根与叶的相似度较低，茎与根呈现一定的相似性。这与董晓慧等（2025）在玉米中的发现一致，即茎、叶和籽粒间真菌群落组成较为接近，与根存在明显区别；但与Araujo等（2020）的研究结果不一致：其根和茎的内生真菌群落相似且两者与叶片不同。这种不一致性反映了内生真菌群落构建的高度可塑性，其最终结构很可能由宿主物种特性、组织微环境、传播途径及生态互作等多重因素共同决定。这种差异可能归因于：根组织直接接触土壤复杂菌群，但面临更强的宿主免疫筛选和根际竞争压力；而茎、叶组织相对隔绝，其内生真菌可能更多依赖于空气传播定殖，并受到组织内特定理化环境，如光照、水分、营养，特别是组织特异性次生代谢物浓度梯度的塑造。本研究结果与Zhou等（2021）对具有柠檬醛代谢产物的油樟植株内生真菌多样性分析具有相似性，进一步支持同一化学型宿主中内生真菌群落存在明显的组织特异性。
在α多样性方面，本研究采用Shannon指数和Simpson指数评估物种多样性，采用Chao指数和Ace指数评估物种丰富度，对3种樟属树种的根、茎和叶进行评估。值得注意的是，Chao和Ace指数表明樟的内生真菌物种丰富度最高，而Shannon指数所呈现的多样性趋势与其他4项指数相反，这与Kong等（2023）在半夏和掌叶半夏中报道的Simpson指数与多样性水平呈负相关，其余指数呈正相关的结论并不完全一致。该现象可能与樟群落中存在显著优势物种有关：少数真菌类群在群落中占绝对主导地位，导致多样性水平下降，并在不同指数中表现出不一致的变化趋势。
3.3 内生真菌群落在宿主柠檬醛生物合成与维持中发挥着潜在的功能性作用
本研究中，丰度占比前15的属有13个属于子囊菌门，说明樟属3种柠檬醛型树种均出现子囊菌富集现象，其中枝孢属、篮状菌属、酵母属、绿僵菌属、弯孢属、镰孢属、曲霉属、青霉属均富含萜烯类物质（常俊男等，2020；安婷等，2024；罗利利等，2025）。这揭示了在樟属植物，尤其是富含萜烯类物质的类型中，子囊菌具有普遍的适应性和生态优势，可能通过直接或间接的机制参与并维持宿主柠檬醛的合成。特定的化学环境如柠檬醛的存在，也可能为某些耐受或利用这些物质的真菌类群提供了生存优势，或抑制了其他敏感类群的定殖。
本研究对于了解樟属柠檬醛型树种及其不同组织中内生真菌群落的组成和特征具有重要价值，为后续樟属柠檬醛型树种内生真菌资源的开发和利用提供了重要的理论依据，也为后续对同一化学型不同树种不同组织部位内生真菌群落组成差异性的研究提供了参考。