摘要
为探究内生真菌RG170（Subsessila turbinata）对肉桂（Cinnamomum cassia）幼苗生理特性及次生代谢产物积累的影响，该研究以分离自健康肉桂叶片的内生真菌RG170为对象，通过体外促生活性测定（包括溶磷、解钾和固氮能力）及无菌共培养体系，评价其促生潜力，并进一步采用盆栽试验验证其对肉桂生长与代谢的实际效应。结果表明：（1）在无菌共培养条件下，接种RG170显著促进了肉桂幼苗的生长，与对照组相比，株高、鲜重、侧根数和叶面积分别提高了15.4%、54.2%、40.1%和29.5%，除株高外，其他均达到显著性差异。（2）盆栽试验中，接种RG170显著提高了肉桂幼苗地下部分的干物质量。（3）与对照组相比，接种RG170幼苗的叶片可溶性糖和可溶性蛋白含量分别显著增加了51.9%和63.8%，超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性分别显著提升了66.5%和279.0%。（4）接种还显著提高了叶片总黄酮和总酚含量，增幅分别为115.3%和113.9%；叶片和茎皮中肉桂醇、肉桂酸以及肉桂醛含量均显著上升，其中肉桂醛含量分别提高35.5%和68.8%。综上，接种具有多种促生特性的RG170菌株，不仅能促进肉桂幼苗生长、提高其生理活性，还能促进总黄酮、肉桂醛等关键次生代谢物的积累。该研究为肉桂微生物菌剂的开发提供了依据。
Abstract
To investigate the effects of the endophytic fungus RG170 (Subsessila turbinata) on the physiological characteristics and secondary metabolite accumulation of Cinnamomum cassia seedlings, the endophytic fungus RG170, isolated from healthy leaves of C. cassia, was used as the research subject. The plant growth-promoting potential was evaluated through in vitro assays assessing phosphate solubilization, potassium solubilization, and nitrogen fixation, as well as through a sterile co-culture system. Pot experiments were further conducted to verify its actual effects on C. cassia growth and metabolism. The results were as follows: (1) Under sterile co-culture conditions, inoculation with RG170 significantly promoted the growth of C. cassia seedlings. Compared with the control, plant height, fresh weight, number of lateral roots, and leaf area increased by 15.4%, 54.2%, 40.1%, and 29.5%, respectively, with all parameters except plant height showing significant differences. (2) In pot experiments, inoculation with RG170 significantly increased the dry biomass of the underground parts of C. cassia seedlings. (3) Compared with the control, the RG170-inoculated seedlings exhibited significantly higher levels of soluble sugars and soluble proteins in leaves, with increases of 51.9% and 63.8%, respectively, while the activities of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) were significantly enhanced by 66.5% and 279.0%, respectively. (4) Inoculation also significantly increased total flavonoid and total phenolic contents in leaves by 115.3% and 113.9%, respectively; the contents of cinnamyl alcohol, cinnamic acid, and cinnamaldehyde in both leaves and stem bark were significantly elevated, with cinnamaldehyde content increasing by 35.5% and 68.8%, respectively. In conclusion, inoculation with the RG170 strain, which possesses multiple growth-promoting traits, not only promotes the growth and enhances the physiological activity of C. cassia seedlings, but also facilitates the accumulation of key secondary metabolites, such as total flavonoids and cinnamaldehyde. This study provides a basis for the development of microbial inoculants for C. cassia.
肉桂（Cinnamomum cassia）是樟科樟属多年生乔木，主要种植于亚热带地区，在我国两广地区及云南等地大面积种植，是广西重点发展的“桂十味”药材之首（陈晓璐等，2021），其干燥树皮及枝均可作中药材，并且作为香料在国际上享有盛誉。肉桂含有挥发油、多糖、倍半萜、黄酮类等多种成分（高铭哲等，2021），其中挥发油为其主要药用成分（国家药典委员会，2020），而肉桂醛是挥发油的核心活性物质（刘婕琳等，2024），具有抗炎、抗菌、抗氧化及扩张血管等作用（王清泉等，2024）。作为全球重要的香料和药材，肉桂市场需求持续增长（李桂兰等，2025）。然而，不同产地的肉桂品质良莠不齐（朱振玲等，2019），部分地区的肉桂中肉桂醛含量普遍低于药典标准，不仅制约了肉桂产业的健康发展，也凸显了从栽培源头提升肉桂品质的迫切性。
中药材的产量与品质受诸多环境因素的影响，这些因素包括非生物性因素与生物性因素。在以往的研究中，非生物性因素如光照（李冠男等，2023）、温度（李彩红等，2023）、水分（金昆等，2025）等受到人们重视，而生物性因素时常被忽略。Liu等（2021）研究发现，生物性因素中的内生真菌对药用植物的生长发育与次生代谢具有重要作用。内生真菌是存在于健康植物体内并能和宿主共生的一类真菌。有研究表明，内生真菌可促进药用植物生长（Khalil et al.，2021；Khalmuratova et al.，2021）、生物活性成分积累（Lindblom et al.，2018；Mastan et al.，2019）以及新型活性化合物生成（Singh et al.，2022），从而影响药用植物的品质。白洋等（2022）发现，接种内生真菌能够显著增加朝鲜淫羊藿的生物量，提高朝鲜淫羊藿总黄酮醇苷及总黄酮含量；吴慧等（2024）发现，菌株NS1、NS6、NS31、NS32和NS33具有多种促生潜力且能改善雷公藤组培苗生长，并促进根和茎中雷公藤红素积累；谢泽碧等（2023）发现，接种真菌Y118可显著或极显著增加两面针的鲜重、株高、茎基宽和茎中宽，有利于促进两面针幼苗生长发育，具有提高两面针药材根、茎、叶鲜重和干重及品质的效应。内生菌对宿主的诸多特殊作用，引起了越来越广泛的关注，同时也为药用植物品质的形成提供了新的思路。
目前，肉桂内生真菌的研究大多聚焦于抗菌活性（王洁等，2024；庞亚琪等，2025），其在系统调控肉桂生理代谢与品质形成中的作用尚待深入探究。尽管组织培养是研究“菌-植”互作的理想体系，但是，樟科植物外植体消毒困难且组培过程易出现褐化（翁小婷等，2023），导致肉桂组培技术近年未有突破，难以获得大量组培苗用于试验。为此，本研究通过构建无菌种子萌发体系获取肉桂无菌苗，以解决试验材料获取受限的问题。前期研究中，课题组从健康肉桂组织中分离获得一株内生真菌RG170，经鉴定为Subsessila turbinata（Beltraniaceae）。Subsessila是Lin等（2017）基于多基因系统发育分析及形态学特征建立的新属，目前仅报道有S. turbinata一种，其典型特征包括具有从辐射状裂片基部细胞产生的深色刚毛，以及独特的陀螺状分生孢子。该物种最初作为腐生真菌发现于热带植物凋落物中，而关于其作为内生真菌与宿主植物相互作用的研究尚未见报道。为此，本研究以前期分离出的内生真菌RG170为试验菌株，采用无菌共培养与盆栽试验方法，系统评估RG170对肉桂生长、生理特性及次生代谢物积累的影响，拟探讨以下问题：（1）内生真菌RG170是否具备稳定的促生能力；（2）内生真菌RG170与肉桂的共生互作是否能够协同促进宿主生长并调控其次生代谢物积累。本研究结果旨在为肉桂的绿色栽培和提质增效提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试菌株：课题组前期从健康肉桂叶组织中分离培养获得的内生真菌RG170，经鉴定为Subsessila turbinata，现保藏于广西中医药大学中药资源研究团队微生物实验室。
肉桂新鲜种子于2024年4月采自广西壮族自治区平南县（110°25′27″E、23°42′59″N），并于当天带回实验室。由广西中医药大学药学院黄荣韶教授鉴定为樟科植物肉桂（Cinnamomum cassia）种子。供试植株为课题组培育的肉桂两年生实生苗。
仪器与试剂：高效液相色谱仪（LC-40，日本岛津公司）；紫外分光光度计（UV-2600，日本岛津公司）；立式压力蒸汽灭菌锅（LDZF-50L，上海申安医疗器械厂）。肉桂醛标准品（LOT：JB253108，上海源叶生物科技有限公司）；肉桂醇标准品（LOT：Y04N7C23850，上海源叶生物科技有限公司）；肉桂酸标准品（LOT：J20IA220018，上海源叶生物科技有限公司）。
1.2 菌株促生活性检测
真菌活化后分别接种于溶磷培养基、解钾培养基和Ashby培养基中，在28 ℃避光条件下培养7 d，观察菌落周围是否产生透明圈，透明圈的出现可作为菌株具备溶解无机磷和解离钾离子的指示标志；而能够在Ashby培养基上生长是菌株具有固氮能力的标准。具体培养基组成参考陈梦（2021）的研究。
1.3 内生真菌与肉桂苗共培养体系构建
取新鲜肉桂种子，依次经75%乙醇（30 s）及2.5%次氯酸钠（18 min）进行表面灭菌。无菌蒸馏水漂洗3次，于超净工作台中将种子转移至水琼脂培养基，在25 ℃、暗培养条件下萌发。25~30 d后，待种子萌发，将其转移至含1/2 MS培养基的组培瓶中（每瓶中有8棵苗）。
选取长势一致且植株健壮的肉桂无菌苗（叶2~3片，侧根3~4条），分组编号并称取鲜重，转移至1/2MS（7.5 g·L-1蔗糖）的共生培养基中。在根部接种新鲜菌饼（直径6 mm）。对照组（CK）接种等量无菌空白琼脂块。每个处理15棵苗，于25 ℃人工气候箱、16 h光周期下共培养45 d。之后对种苗生长状况进行分析，包括株高、鲜重、侧根数及叶面积等生长指标（孟娉等，2017）。
1.4 菌剂的制备与盆栽试验
按照以下配方配制菌剂：88%玉米芯+10%麦麸+1%石膏+1%石灰。料水质量比为1∶1，将水倒入干样，搅拌均匀，分装培养瓶中，灭菌后冷却备用。将已活化的直径为 6 mm的RG170菌饼置于无菌培养瓶中央，密封，于28 ℃下培养30 d，即为RG170菌剂。
选取生长状况良好、长势一致的肉桂实生苗，种植于内径15 cm，高17.5 cm的塑料花盆内（用质量分数0.5%的高锰酸钾溶液浸泡消毒，之后用无菌水冲洗3次，晾干备用）。栽培土为泥炭土和蛭石（2∶1）按体积比混合，混合后于121 ℃高压灭菌锅中灭菌30 min。肉桂实生苗统一管理，本试验在广西中医药大学温室大棚进行。采用完全随机试验设计，实验组为使根部与菌剂均匀接触，每盆菌剂适宜接种量为30 g，先将基质铺好，植株移入后将菌剂均匀铺至与根部接触，再铺一层基质覆盖菌剂，对照组施加等量无菌基质，每日浇灌等量适宜蒸馏水，90 d后对其进行生物量以及生理指标测定。
1.5 测定指标与方法
1.5.1 盆栽苗生物量的测定
共生90 d后收获肉桂植株，每个处理随机挑选6株，从根基部剪下，称量叶、根鲜重，记录鲜重，之后将各部位阴干至恒重，记录干重。
1.5.2 渗透调节物质及抗氧化活性的测定
可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定；可溶性蛋白含量参照Biosharp BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书测定。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性采用氮蓝四唑(NBT)法测定；过氧化物酶（peroxidase，POD）活性采用愈创木酚法测定；过氧化氢酶（catalase，CAT）活性采用紫外分光光度法测定，具体操作参考李小方和张志良（2016）的方法。
1.5.3 总黄酮、总酚含量的测定
总黄酮含量测定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法测定；总酚含量采用福林酚法测定。
1.5.4 肉桂主要活性成分含量测定
使用HPLC对肉桂叶和茎皮中肉桂醇、肉桂酸和肉桂醛的含量进行测定。
（1）混合对照品溶液的制备
精密称取对照品（肉桂醇3.96 mg、肉桂酸2.72 mg、肉桂醛62.94 mg），置10 mL容量瓶内，加甲醇溶解，并稀释至刻度，得到各对照品储备液。分别量取100 μL对照品储备液于1 mL 量瓶内，加甲醇稀释至刻度，得到含 39.60 mg·L-1肉桂醇、27.20 mg·L-1肉桂酸、629.4 mg·L-1肉桂醛的混合对照品溶液，依次稀释1、1.25、2.5、5、10倍，得到1#~5#混合对照品溶液，备用。以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标。分别对上述对照品进行线性回归，结果见表1，色谱图见图1。
表
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肉桂3种成分回归方程
Table
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Regression equations for three components of Cinnamomum cassia
（2）样品溶液的制备
取共生后叶片、茎皮干样，研磨成粉末（过40目筛），精密称定0.100 0 g，加入5 mL 甲醇，密塞称重，再超声30 min，放冷后补足失重，5 000 r·min-1 离心 10 min。上清液过0.22 μm滤膜，收集滤液备用。
液相条件主要包括：a)色谱柱：VisionHT C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；b) 流动相：A相为体积分数0.1%磷酸水溶液，C相为乙腈；体积流量为0.8 mL·min-1；柱温为30 ℃；进样量为10 μL，检测波长为265 nm，液相洗脱程序见表2。
表
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梯度洗脱程序
Table
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Gradient elution program
图
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HPLC 色谱图
Fig.
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HPLC chromatogram
1.6 数据统计与分析
利用Excel进行数据整理，采用Origin 2024进行绘图，运用SPSS软件进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 菌株体外促生活性分析
促进植物对氮、磷、钾等营养元素的吸收是内生真菌促进植物生长的主要作用方式。由图2可知：内生真菌RG170在无机磷培养基上未形成透明圈，表明其不具有明显的无机磷溶解能力；能够在解钾培养基上产生透明圈，表明其具有一定的解钾作用；能够在Ashby培养基上正常生长，表明其具有一定的固氮作用。
图
2
内生真菌RG170在不同培养基上的菌落形态
Fig.
2
Colony morphology of endophytic fungus RG170 on different culture media
2.2 内生真菌RG170对肉桂无菌苗生长的影响
菌株RG170接种入肉桂根部后能够显著促进种苗的生长发育（图3）。由表3可知，与CK相比，处理组肉桂的株高、鲜重、侧根数、叶面积分别提高了15.4%、54.2%、40.1%、29.5%，除株高外，其他均达到显著性差异。这表明在无菌培养条件下，RG170对肉桂的生长具有促进作用。
表
3
内生真菌 RG170 对肉桂无菌苗生长的影响
Table
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Effects of endophytic fungus RG170 on the growth of Cinnamomum cassia aseptic seedlings
图
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内生真菌RG170对肉桂生长发育的促进作用
Fig.
3
Promoting effect of endophytic fungus RG170 on the growth and development of Cinnamomum cassia
2.3 内生真菌RG170对肉桂盆栽苗生物量的影响
由表4可知，经过90 d的共生培养，与CK相比，接种内生真菌RG170对肉桂植株的叶片鲜重和干重无显著影响，但增加了地下鲜重和干重，其中地下干重达显著水平。这表明RG170菌株对肉桂植株的地下部分作用明显。
表
4
接种内生真菌 RG170 对肉桂生物量的影响
Table
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Effects of inoculation with endophytic fungus RG170 on the biomass of Cinnamomum cassia
2.4 内生真菌RG170对肉桂盆栽苗生理特性的影响
由图4可知，接种RG170显著提高了肉桂叶片的渗透调节物质含量和抗氧化酶活性。与CK相比，接种RG170后可溶性糖含量和可溶性蛋白含量分别上升了51.9%（图4：A）和63.8%（图4：B），均有显著性差异（𝑃<0.05）。与CK相比，接种RG170的肉桂幼苗SOD、POD、CAT活性分别提高了66.5%、5.9%、279.0%（图4：C-E），其中SOD、CAT达到显著性差异（𝑃<0.05）。
图
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内生真菌 RG170 对肉桂盆栽苗生理特性的影响
Fig.
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Effects of endophytic fungus RG170 on physiological characteristics of Cinnamomum cassia
2.5 内生真菌RG170对肉桂盆栽苗次生代谢产物的影响
由图5可知，接种RG170显著促进了肉桂叶片的总黄酮、总酚及3种活性成分的积累。与CK相比，接种内生真菌RG170后，总黄酮含量和总酚含量分别提升了115.3%（图5：A）和113.9%（图5：B），有显著性差异（𝑃<0.05）。与CK相比，接种RG170处理组的肉桂叶片中肉桂醇、肉桂酸、肉桂醛含量分别上升了117.2%、77.8%、35.5%（图5：C），均有显著性差异（𝑃<0.05）；茎皮中肉桂醇、肉桂酸、肉桂醛含量分别上升了55.7%、55.0%、68.8%，均有显著性差异（𝑃<0.05）（图5：D）。
图
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内生真菌RG170对肉桂次生代谢产物的影响
Fig.
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Effects of endophytic fungus RG170 on secondary metabolites of Cinnamomum cassia
3 讨论与结论
本研究系统评估了内生真菌RG170对肉桂生长及代谢的影响。结果发现，RG170接种不仅显著促进了肉桂幼苗的生长，还提高了其生理代谢活性，并促进了多种关键次生代谢物的积累，表明该菌株在调控宿主生长与品质方面具有潜在应用价值。已有研究表明，内生真菌能够通过多种途径影响宿主植物的生长与代谢，包括促进植物激素合成、增强矿质养分吸收以及提高植物对生物与非生物胁迫的耐受能力（Masoudi et al.，2023；Yang et al.，2023）。然而，由于不同菌株在代谢功能及生态适应性方面存在差异，因此其促生机制亦呈现出明显的多样性。在本研究中，RG170表现出解钾和固氮能力，推测其促生作用可能与养分供应增强有关。在无菌条件下开展的共生试验表明，接种RG170后肉桂幼苗的鲜重、侧根数和叶面积均显著增加，说明该菌株能够有效促进宿主生长。这一结果与张玉银等（2025）的研究结论相一致，即内生真菌能够通过改善养分供应来促进植物生长。然而，实验室条件下的促生效果并不一定能够在自然环境中稳定发挥。Copeland等（2025）指出，在实际生态系统中，由于微生物之间存在复杂的竞争与互作关系，因此许多在简化培养条件下表现良好的菌株在实际应用中往往难以维持稳定功能。
为验证RG170在复杂环境中的促生潜力，本研究进一步开展了非无菌盆栽试验。结果显示，于存在环境微生物竞争的条件下，接种RG170仍然能够显著提高肉桂地下部分的生物量，说明该菌株在复杂生态位中仍具有较强的生态适应能力和功能稳定性。根系结构是决定植物养分吸收效率的重要因素。Damayanti等（2019）的研究表明，内生真菌能够通过调节植物生长素水平促进侧根形成，从而扩大根系吸收面积并提高养分利用效率。结合本研究中地下部分生物量增加的结果，推测RG170可能通过促进根系发育来增强肉桂对土壤养分的获取能力，从而提高其生长表现。
本研究结果表明，接种RG170显著提高了肉桂幼苗可溶性糖和可溶性蛋白的含量。可溶性糖不仅是植物能量代谢的重要中间产物，同时也是重要的渗透调节物质，而可溶性蛋白则反映了植物体内蛋白质合成及氮代谢水平（Bollhöner et al.，2012）。因此，这些指标的升高通常意味着植物代谢能力的增强。考虑到RG170具有固氮能力，推测其可能通过提供可利用氮源来促进宿主蛋白质合成，从而提高光合相关酶系活性并促进碳同化过程，最终形成碳氮代谢协同增强的生理效应。此外，接种RG170后肉桂植株中SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性均有所提高，其中SOD和CAT达到显著水平。抗氧化酶系统是植物清除活性氧、维持细胞氧化还原平衡的重要防御体系（齐庆茹和王雷，2024）。王致尧等（2026）研究表明，内生真菌能够通过诱导植物抗氧化防御系统来提高其抗逆能力和代谢活性。因此，本研究中抗氧化酶活性的增强可能是RG170促进肉桂生理活性的重要机制之一，有助于维持细胞氧化还原稳态，从而支持植株的正常生长和代谢活动。
除生长和生理效应外，RG170还显著促进了肉桂次生代谢物的积累。本研究发现，接种RG170后肉桂的总黄酮、总酚及肉桂醛含量均显著提高。黄酮类和酚类化合物是植物体内重要的抗氧化活性物质，在植物防御反应及生长调控中发挥重要作用（罗娅等，2015）。这些化合物主要通过苯丙烷代谢途径合成，其中苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）及4-香豆酰辅酶A连接酶（4CL）等关键酶的催化下形成多种重要中间产物，并进一步参与不同分支代谢途径（陈志杰等，2018；Liu et al.，2021）。本研究中，多种苯丙烷途径产物的同步增加，表明RG170可能通过调控该代谢途径上游关键节点，提高整体代谢通量，从而促进多种次生代谢物的协同积累。类似现象在植物-内生真菌互作研究中亦有报道，即内生真菌能够通过调控苯丙烷代谢相关酶的表达或活性来增强植物次生代谢水平（Jia et al.，2025）。
综上所述，内生真菌RG170能够通过多层次调控促进肉桂的生长与代谢，包括增强根系发育、提高碳氮代谢水平、激活抗氧化防御体系以及促进苯丙烷代谢途径相关次生代谢物的积累。这些结果表明RG170在提高肉桂产量与品质方面具有潜在应用价值。未来研究可从以下两个方面深入：一是结合转录组测序与qRT-PCR技术，系统解析RG170对苯丙烷代谢通路中关键酶基因表达的调控网络，以阐明其促进次生代谢物积累的分子机制；二是探索该菌株与其他有益真菌的协同效应，评估联合接种对肉桂生长及品质的综合影响。这些研究将进一步推动高效微生物菌剂的研发，为中药材的绿色优质栽培提供科学支撑。