摘要
为揭示喀斯特生境中硬叶兜兰（Paphiopedilum micranthum）不同生态型对氮素的适应机制，该研究以滇东南同一石灰岩区域分布的3种生态型（岩生型、灌丛地生型、林下地生型）硬叶兜兰为对象，旨在比较其氮素吸收与利用效率的差异，并从碳氮分配角度阐明其生态适应策略。该研究通过测定定居地土壤有效氮含量、分析植株氮表型及关键氮代谢酶活性，比较不同生态型在氮积累与利用效率方面的差异，并进行关联因素分析。结果表明：（1）不同生态型硬叶兜兰氮吸收效率（NUpE）无显著性差异，而氮利用效率（NUE）存在显著分化（𝑃<0.05），岩生型[(2.83±0.14) g·mg-1]和林下地生型[(2.83±0.05) g·mg-1]的NUE显著高于灌丛地生型[(2.64±0.22) g·mg-1]。（2）不同生态型间形成了差异化的适应策略：林下地生型的总根长[(64.80±9.86) cm]与根冠比（0.95±0.22）显著高于岩生型[总根长(50.26±17.50) cm，根冠比0.72±0.17]；岩生型则具有最高的单位根长吸氮量，显著高于林下地生型（𝑃<0.05）；灌丛地生型表现为强硝态氮同化能力，其硝酸还原酶活性[(49.37±1.08) μg ·g-1·h-1]及叶氮浓度均为三者最高。（3）碳氮分配策略迥异：岩生型全株碳氮比（C/N）最高；灌丛地生型碳氮积累量最大但C/N最低；林下地生型各项指标多居中。（4）关联分析显示，氮利用效率与总根长、根部碳积累量及叶片C/N呈显著正相关，而与土壤铵态氮含量呈显著负相关。综上，不同生态型的硬叶兜兰通过调控根系构型、碳氮分配，形成了互补的氮适应机制。岩生型硬叶兜兰凭借更高的单位根长吸氮量和较高的C/N所体现的资源分配策略，实现了最高的氮素利用效率。该研究通过对比生态型在氮吸收利用效率及氮代谢生理特性的差异，从碳氮分配的角度揭示了硬叶兜兰的生态适应机制，为该物种的科学保护与人工栽培提供了理论依据。
Abstract
To reveal the nitrogen adaptation mechanisms of different Paphiopedilum micranthum ecotypes in karst habitats, this study focused on three ecotypes (lithophytic type, scrub terrestrial type, and understory terrestrial type) co-occurring in a limestone area in southeastern Yunnan. We aimed to compare their nitrogen uptake and utilization efficiencies and elucidate their ecological adaptation strategies from the perspective of carbon-nitrogen allocation. By measuring soil available nitrogen content, and analyzing plant N phenotypes along with the activities of key N metabolism enzymes. We compared inter-ecotype differences in N accumulation and use efficiency, followed by correlation analysis of influencing factors. The results were as follows: (1) No significant difference was observed in nitrogen uptake efficiency (NUpE), while nitrogen use efficiency (NUE) differed significantly among ecotypes (𝑃<0.05). The lithophytic type [(2.83±0.14) g·mg-1] and the understory terrestrial type [(2.83±0.05) g·mg-1] exhibited significantly higher NUE than the scrub terrestrial type [(2.64±0.22) g·mg-1]. (2) Divergent adaptive characteristics were formed: the understory terrestrial type had significantly greater total root length [(64.80±9.86) cm] and root-to-shoot ratio (0.95±0.22) than the lithophytic type [total root length: (50.26±17.50) cm; root-to-shoot ratio: 0.72±0.17]. In contrast, the lithophytic type displayed the highest nitrogen uptake per unit root length, significantly surpassing the understory terrestrial type (𝑃<0.05). The scrub terrestrial type demonstrated a strong nitrate assimilation capacity, possessing the highest nitrate reductase activity [(49.37±1.08) μg·g-1·h-1] and leaf N concentration. (3) Carbon-nitrogen allocation strategies differed markedly: the lithophytic type had the highest whole-plant carbon-to-nitrogen ratio (C/N), whereas the scrub terrestrial type exhibited the greatest C and N accumulations but the lowest C/N. The understory terrestrial type generally displayed intermediate values for these traits. (4) The correlation analysis showed that, nitrogen use efficiency was significantly positively correlated with total root length, root carbon accumulation, and leaf C/N, and significantly negatively correlated with soil ammonium nitrogen content. In conclusion, the different ecotypes develop complementary nitrogen adaptation mechanisms by regulating root architecture and carbon-nitrogen allocation. The lithophytic type achieved the highest nitrogen use efficiency through more nitrogen uptake per unit root length and a resource allocation strategy characterized by a higher C/N. By comparing the differences in nitrogen uptake/use efficiency and N metabolism physiology among ecotypes, this study elucidates their ecological adaptation mechanisms from the perspective of carbon-nitrogen allocation, and provides a theoretical basis for the scientific conservation and cultivation of this species.
植物在贫氮生境中的氮素利用策略是养分生态研究的热点问题，对于揭示植物的环境适应性与进化机制具有重要的理论意义。植物对氮素的利用效率（nitrogen use efficiency, NUE）是一个综合性的功能性状，反映了其从获取到利用氮资源的整体效能（Wang et al., 2019；Wani et al., 2021；Yan et al., 2023）。在实际研究中，植株不同器官的氮含量、氮积累量以及碳氮比（C/N）等指标，常被用作评估其氮素利用策略与效率的重要代理参数（符裕红等，2020；Chang et al., 2024）。植物氮素利用效率的高低受到土壤氮供应、生境条件以及植物自身遗传特性与表型可塑性的复杂网络调控（Xu & Takahashi, 2020；Govindasamy et al., 2023）。不同物种乃至同一物种的不同生态型或基因型，在根系构型、氮吸收动力学偏好以及氮同化关键酶活性上存在差异，这些差异共同塑造了其独特的氮素利用效率（Duan et al., 2023；Wang et al., 2023；Tang et al., 2023）。例如，高原生态型藜麦相较于平原生态型表现出更高的氮吸收效率，与其根系形态的适应性分化有关（Pinto-Irish et al., 2020）。在低氮胁迫下，植物常通过调整氮在源库器官间的分配比例、维持较高的C/N来优化碳氮代谢平衡，从而在资源受限条件下优先保证生存与防御（Yao et al., 2019；周俊妞等，2020；杜娇艳等，2023）。
喀斯特地区地貌高度异质化，土层薄且土壤分布不连续，淋溶作用强烈，导致土壤氮素流失严重，具有典型贫氮胁迫生境的特性（Xiong et al., 2023）。植物在长期自然选择压力下，往往演化出一系列提高氮素捕获与利用效率的性状（Zhong et al., 2022；Govindasamy et al., 2023）。兰科植物作为植物界生活型极为多样的家族之一，在适应氮素限制方面表现出明显的策略分化。有研究表明，附生兰常表现出生长速率缓慢、叶片氮浓度较低和植株C/N较高的特征，通过降低氮素消耗来提高氮利用效率，而许多地生兰具有较高的叶片氮含量以支持快速光合作用，C/N较低（Feng et al., 2022；吴天柔等，2023）。然而，同一物种内不同生态型在氮素适应策略方面是否存在分化，目前尚不清楚。
硬叶兜兰（Paphiopedilum micranthum）为兰科兜兰属二级保护植物，分布于云南东南、贵州西南和东北以及黔桂交界北部石灰岩区域（张央等，2021）。该物种偏好喀斯特山地中岩石陡峭地形或有风积土的洼地，性喜透气性与排水性良好的半阴环境。作为典型的喀斯特植物，硬叶兜兰的原生境土层浅薄、氮素淋溶强烈，长期面临氮素胁迫，其在根形态上已表现出对贫瘠、干旱岩生生境的特殊适应（Zhao & Zhang, 2025）。尽管已有研究关注兰科植物在附生与地生类型间的氮策略分化，但对于同一物种内不同生态型（如岩生型与地生型）如何通过微生境适应来分化氮素利用策略，目前尚属空白。因此，本研究选取云南东南部硬叶兜兰核心分布区域，以相同生境中岩生型与两种地生型（林下型、灌丛型）植物为对象，采用野外取样与室内生理分析相结合的方法，通过测定其微生境土壤氮素特性、植株根系与叶片表型性状，以及氮吸收同化关键酶活性与碳氮分配格局，拟探讨以下问题：（1）在同一分布区域内，不同生态型硬叶兜兰在氮吸收效率与氮利用效率上是否存在显著分化；（2）为适应贫氮生境，不同生态型是否形成了差异化的根系构型（如根冠比、单位根长吸氮量）与氮代谢生理特性（如硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶活性）；（3）其碳氮在不同器官中的分配策略（如C/N、氮积累量）如何共同影响其整体的氮素利用效率，进而反映其各自的生态适应机制。本研究旨在从碳氮分配与氮代谢生理的角度出发，揭示硬叶兜兰不同生态型对石灰岩贫瘠生境的微适应机制，以期为该濒危物种的精准保育与栽培管理提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 研究区域概况
本研究区域位于云南省文山州硬叶兜兰核心分布区，该地区属于亚热带季风气候，年均温16.5 ℃，年均降水量1 100 mm。该区域为典型的喀斯特地貌，地形破碎，土壤以石灰土为主，土层浅薄且贫瘠，氮素淋溶强烈，生境异质性高。在此区域内，硬叶兜兰主要分布于石缝、石壁（岩生生态型）及林下和灌丛（地生生态型）等多种微环境中。具体采样点位于文山市小坝子山（104°20′44.5″E、23°22′46.6″N）。
1.2 取样方法
本研究涉及的硬叶兜兰为国家二级重点保护野生植物。采样工作严格遵守《中华人民共和国野生植物保护条例》及相关科研伦理规范，在开展野外工作前已与地方林业主管部门进行了充分沟通，并获得了开展科学研究的许可与支持。采样后对植株根系及周边基质进行回填与压实，最大限度降低对植株生长和微生境的干扰。
本研究涉及的3种生态型根据其微生境特征进行划分，具体生境特点详见表1。其中，灌丛地生型与林下地生型虽同属“地生”类别，但其微生境存在显著性差异：灌丛地生型生长于低矮灌木丛（高40~50 cm）中，植被覆盖以杜鹃科、蔷薇科等灌木为主，冠层结构稀疏，光照条件较好（郁闭度40%~50%），林内可见斑驳阳光，凋落物层较薄，土壤湿度相对较低；林下地生型则分布于乔木林下（高150~170 cm），以壳斗科、樟科等乔木为优势种，冠层结构紧密，光照条件较差（郁闭度60%~70%），林内以散射光为主，凋落物层较厚，土壤湿度相对较高。两类生境在植被组成、光照强度、凋落物厚度及土壤水分状况上形成梯度差异，这些差异可能共同驱动了两种地生型在氮素利用策略上的分化。每类生态型选择3~4个居群进行土壤样本和植株样本采集。土壤理化性质测定选择不同种群的代表个体，同一种生态型的硬叶兜兰每个种群随机抽取4~5个体采集的土样按等量混合均匀后作为该类型的1个土壤样本，每类生态型作3个重复，岩生型共采集12个个体土样，林下地生型和灌丛地生型各采集15个个体土样。采用“抖落法”采集土样，去除可见植物残体，过孔径2 mm筛后带回实验室，用于分析土壤理化性质。选择长势良好、大小相近的植株进行生物学采样，个体材料用锡纸包裹加冰包装，带回实验室。植物表型测定：对每一生态型选取3个种群作为生物学重复，每个种群设3个重复，每个生态型选取9个样本。植物关键指标测定：从每个生态型中选取3个种群，每个种群随机抽取3个植株个体的剪碎叶片等量混合后作1个重复，共计3个重复。
表
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硬叶兜兰生境特点
Table
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Habitat characteristics of Paphiopedilum micranthum
1.3 试验方法
1.3.1 土壤样品分析
硝态氮和铵态氮测试使用新鲜土样，其他理化指标测试使用风干土样。土壤全氮、碱解氮、硝态氮、铵态氮、有机质、有效磷、速效钾含量、土壤含水量测试方法参阅鲍士旦（2000）的方法。
1.3.2 植物表型测定
将样品置于105 ℃烘箱（产品型号：MOV-212F，日本）中杀青30 min，再转移至（65±2）℃条件下烘干至恒重。分别称量地上部分与根的干重，并计算总生物量及根冠比（Cun et al., 2023）。根系总长度使用ImageJ软件（National Institutes of Science, USA）进行数字化测量。
1.3.3 氮碳同化关键指标测定
选择光合碳同化过程的关键酶1,5-二磷酸核酮糖羧化酶（ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase, RuBPCase），以及氮代谢途径的关键酶——硝酸还原酶[nitrate reductase, NR，以单位鲜重（𝗀）叶片单位时间（h）内还原的NO2-（μg）为单位]和谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase, GS）进行测试。取样时，从每株生长健壮、无病虫害的植株上，选取从茎基部计数的第2片成熟功能叶。叶片经蒸馏水快速洗净、擦干后剪碎，准确称取适量样品，置于2 mL离心管中，立即投入液氮中速冻，随后转移至-80 ℃超低温冰箱保存，用于后续指标测定。
叶绿素a、b含量采用80%丙酮浸取法测定（赵京东等，2020）；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250染色法（焦洁，2016）测定；NR活性参照陈薇和张德颐（1980）的方法测定；RuBPCase活性和GS活性参照《植物生理学实验》（刘萍等，2016）中所述流程进行测定。
1.3.4 植物碳氮含量测定
将烘干后的叶和根粉碎并过0.25 mm筛，用凯氏定氮法测定叶片和根部的氮含量，采用湿烧法(K2Cr2O7-H2SO4氧化法)测定叶片和根部的碳含量（鲍士旦，2000），计算碳氮比（C/N），每一类型作3个重复。
1.3.5 氮效率相关指标的计算
氮吸收效率（nitrogen uptake efficiency，NUpE）计算参考吴姝瑾等（2022）的方法，氮利用效率（NUE）计算参考徐红卫等（2024）的方法，单位根长吸氮量（nitrogen uptake per unit root length，NURL）计算参考战健等（2023）的方法，计算公式如下：
植株氮积累量(mg)= 叶干重×叶氮含量+根干重×根氮含量；
植株氮(碳)含量(mg.cm-1)= 植株氮(碳) 积累量/ 植株生物量；
氮吸收效率(NUpE)(%)= 植株氮含量/ 土壤全氮含量×100；
氮利用效率(NUE)(mg.cm-1)= 植株干重/ 植株氮积累量；
单位根长吸氮量(NURL)(mg.cm-1)= 植株氮累积量/ 总根长。
1.3.6 数据分析
通过 SPSS 27.01软件（IBM，USA）进行数据统计分析，获取均值与标准差，利用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较不同生态型硬叶兜兰的差异性，邓肯多重比较法检验差异显著性(𝑃<0.05)。利用Z-score法将本研究得到的所有数据标准化处理，用皮尔逊相关系数分析各指标之间的相关性，使用ChiPlot云平台（https://www.chiplot.online/.）绘制热图，用𝑃<0.05的阈值提取显著相关系数，用Cytoscape v3.7.2构建关系网络图。为甄别影响氮素利用效率的主导环境因子，进一步作冗余分析（redundancy analysis，RDA），在Canoco 5软件（Version 5.0, Microcomputer Power, Ithaca, NY, USA）中完成。
2 结果与分析
2.1 3种生态型定居地的土壤理化性质
土壤氮素分析表明，不同生态型间土壤氮形态存在差异（表2）。两类地生生态型的土壤全氮含量在数值上高于岩生型，但差异未达显著水平。硝态氮含量在林下地生型中显著低于灌丛地生型与岩生型（𝑃<0.05）。此外，灌丛地生型的土壤铵态氮含量显著高于其他两种生态型。土壤氮素形态与含量的差异，可能驱动了不同生态型在根系构型上的适应性分化。
表
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3种生态型硬叶兜兰定居生境的土壤理化性质
Table
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Physical and chemical properties of soil of Paphiopedilum micranthum in three ecotypes
2.2 不同生态型植株表型差异
不同生态型硬叶兜兰在根系构型上存在显著差异（表3）。林下地生型具有最大的总根长和最高的根冠比，其总根长显著大于岩生型与灌丛地生型，根冠比显著高于岩生型。灌丛地生型的根冠比介于二者之间，与两者均无显著性差异。各生态型间的植株总生物量无显著性差异。
表
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3种生态型中硬叶兜兰的生长指标
Table
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Growth indicators of Paphiopedilum micranthum in three ecotypes
2.3 3种生态型硬叶兜兰关键叶片生理指标比较
如图1所示，岩生型和灌丛地生型的硬叶兜兰叶绿素a、叶绿素b含量均显著高于林下地生型。灌丛地生型的硝酸还原酶活性[（49.37±1.08）μg ·g-1·h-1]显著高于岩生型[（43.39±2.81）μg·g-1·h-1]和林下地生型[（41.54±1.45）μg·g-1·h-1]。岩生型植株的可溶性蛋白含量[（1.35±0.10）mg·g-1]、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶活性[（662.69±16.57）U·L-1]、硝酸还原酶活性、谷氨酰胺合成酶活性[（52.10±1.55）U·L-1]都显著低于灌丛地生型（𝑃<0.05）。两类地生型植株除了在谷氨酰胺合成酶活性上无显著性差异外，其他生理指标均差异显著。总体而言，灌丛地生型硬叶兜兰的叶片关键氮素代谢生理指标高于林下地生型硬叶兜兰。叶片氮代谢关键酶活性的差异，预示着不同生态型在氮同化效率和最终产物的积累上可能存在不同，这直接反映在植株的碳氮含量上。
图
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3种生态型硬叶兜兰叶片关键氮素代谢生理指标比较
Fig.
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Comparison of key physiological indicators of nitrogen metabolism in leaves among three ecotypes of Paphiopedilum micranthum
2.4 3种生态型硬叶兜兰的碳氮含量及积累量
灌丛地生型的硬叶兜兰叶氮含量为（0.431±0.04）mg·g-1，植株氮含量为（0.396±0.02）mg·g-1，显著高于其他两个类型（𝑃<0.05），但3种生态型中植株根氮含量皆无显著性差异，所有生态型硬叶兜兰在叶氮积累量方面无显著性差异，而岩生型植株氮积累量显著高于其他生态型（𝑃<0.05）（图2：A）。尽管林下地生型与灌丛地生型在根干重（表2）和根氮含量（图2）上单独比较均未达到显著性差异，但林下地生型在这两个指标上均呈现较高的数值趋势，二者的协同作用使其根氮积累量显著高于灌丛地生型。岩生型植株叶碳含量为（9.64±0.92）mg·g-1，显著高于林下地生型但与灌丛地生型无明显差异（图2：B）。岩生型叶碳积累量显著高于地生型，岩生型植株碳积累量也高于两种地生型，与灌丛地生型有显著性差异（𝑃<0.05）（图2：C）。
图
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3种生态型硬叶兜兰氮、碳含量及积累量比较
Fig.
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Comparison of nitrogen and carbon contents and accumulations among three ecotypes of Paphiopedilum micranthum
2.5 不同生态型的氮吸收利用效率差异
一般而言，植物C/N被用来估计长期的氮利用效率。如图3：A所示，不同生态型硬叶兜兰的叶C/N存在显著性差异，岩生型>林下地生型>灌丛地生型；地生型的植株C/N显著低于岩生型。由图3：B可知，岩生型硬叶兜兰的单位根长吸氮量（NURL）显著高于林下地生型（P<0.05）；岩生型的氮吸收效率均值最高，但与其他生态型无显著性差异（P<0.05）；岩生型和林下地生型的硬叶兜兰氮利用效率分别为（2.83±0.14）g·mg-1、（2.83±0.05）g·mg-1，显著高于灌丛地生型[（2.64±0.22）g·mg-1]（𝑃<0.05）。
图
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3种生态型硬叶兜兰碳氮比及氮效率相关指标比较
Fig.
3
Comparison of carbon-to-nitrogen ratios and nitrogen-related efficiency indicators among three ecotypes of Paphiopedilum micranthum
2.6 氮利用效率与环境及植物性状的关系
如图4所示，氮利用效率与土壤总氮、硝态氮含量、碱解氮含量和铵态氮含量存在负相关关系，其中与碱解氮含量和铵态氮含量显著负相关（𝑃<0.05）。氮利用效率与植物总根长、根干重、生物量、根碳氮积累量和叶C/N均存在显著正相关关系（𝑃<0.05），与硝酸还原酶活性、可溶性蛋白含量、叶氮含量、植株氮含量呈极显著负相关关系（𝑃<0.01）。虽然各生态型的氮吸收效率无显著性差异，但氮吸收效率与土壤全氮含量呈显著负相关，与根氮含量呈显著正相关；氮利用效率与叶片的硝酸还原酶活性、可溶性蛋白含量、植株氮、根氮含量呈负相关，与土壤碱解氮和铵态氮含量呈显著负相关（𝑃<0.05），与植物总根长、生物量、根碳氮积累量和叶C/N均存在显著正相关关系。土壤硝态氮含量与叶绿素a和b含量、叶片硝酸还原酶活性呈显著正相关，但与氮吸收利用效率均无显著关系；铵态氮与叶片硝酸还原酶活性、可溶性蛋白含量、植物体的氮和碳含量呈显著正相关。碱解氮显著地增加叶片中的可溶性蛋白、硝酸还原酶、叶片氮和植株氮含量、根氮和植株碳含量，促进根C/N增加（图5：a）。冗余分析（RDA）的前两排序轴共同解释了植物性状总变异的97.73%，其中第一轴（RDA1）贡献了95.85%的解释量，并且RDA1轴与硝态氮含量、铵态氮含量、郁闭度及速效钾含量存在显著相关性（图5：b）。由此可见，由硝态氮含量、铵态氮含量、郁闭度及速效钾含量构成的梯度，是导致生态型间差异的决定性环境驱动力。
图
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硬叶兜兰氮利用效率与土壤、植物性状的相关性热图
Fig.
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Correlation heatmap of nitrogen use efficiency with soil and plant traits in Paphiopedilum micranthum
图
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硬叶兜兰氮利用效率与土壤、植物性状的相关性及冗余分析
Fig.
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Correlation and redundancy analysis (RDA) of nitrogen use efficiency with soil and plant traits in Paphiopedilum micranthum
3 讨论与结论
3.1 讨论
3.1.1 不同生态型硬叶兜兰的氮效率分化
本研究揭示，尽管分布于相同的石灰岩区域，但是硬叶兜兰的岩生型与地生型在维持氮素营养上具有显著性差异，其核心差异并非体现在氮的获取能力，而在于对氮素的后续利用与分配效率。本研究结果表明，虽然3种生态型硬叶兜兰在氮吸收效率上未表现出显著性差异，但在决定生长表现的关键环节——氮利用效率上则存在显著分化，其中岩生型具有最高的氮利用效率。植物的氮利用效率是其响应土壤氮素环境的核心表现（Wang et al., 2019），即使在相近的大生境下，微生境的异质性也会驱动同种植物在资源利用效率上产生显著的生态型分化。岩生型较高的氮利用效率，与其在贫瘠、保水能力差的石缝生境中生存的选择压力密切相关。这一发现与Pinto-Irish等（2020）在藜麦不同生态型中观察到的氮吸收效率分化有所不同，暗示喀斯特生境特有的选择压力可能更侧重于氮的“内部利用效率”而非“外部吸收效率”。此外，与同属喀斯特分布的其他兰科植物相比，硬叶兜兰生态型间的氮利用效率分化更为精细，表明该物种在微生境适应过程中形成了独特的氮素经济策略（吴天柔等，2023；王琨，2023）。
3.1.2 差异化根系构型与氮代谢生理特征
植物根的功能性状（根系生物量、形态结构等）能够直接反映植物对氮的适应性（何洁等，2021）。为适应贫氮生境，不同生态型形成了互补的适应特征。在根系层面，林下地生型其总根长与根冠比显著最高，这与高山植物通过增加根长来提高资源获取能力的策略相符（Zheng et al., 2025），本质上是通过增大土壤探索范围来适应林下相对均一但可能深层化的氮素分布。与此相反，岩生型其单位根长吸氮量最高，体现了其根系在单位效率上的优势，这可能是对岩缝中养分斑块化分布的高度适应。在氮代谢途径上，灌丛地生型具有高效的硝态氮同化表现，其叶片氮含量、硝酸还原酶活性、叶绿素含量及1,5-二磷酸核酮糖羧化酶活性均最高，显示出较强的光驱动硝态氮还原与同化能力（Duan et al., 2023）。然而，岩生型则倾向铵态氮利用，虽然其谷氨酰胺合成酶活性不高，但结合其生境土壤以铵态氮为主以及RDA结果显示铵态氮是其主导因子的特征，暗示其更倾向于直接吸收并同化耗能更低的铵态氮（Hou et al., 2018），硬叶兜兰偏好吸收铵态氮，可避免硝态氮还原所需的能量消耗，从而在贫氮生境中提高氮利用效率（段永康等，2022；张秦泽等，2024）。此外，林下地生型较高的根冠比（0.95）可反映在弱光胁迫下，植物将更多同化产物分配给地下部分，以增强养分和水分吸收来补偿地上部光合作用的不足。这种根系构型与氮代谢途径的协同分化，在喀斯特植物中具有典型性。与同域分布的兜兰属其他物种相比（如带叶兜兰），硬叶兜兰岩生型表现出更为极端的单位根长吸氮效率，这可能与其专性岩生生境的长期适应有关（Zhao & Zhang, 2025）。
3.1.3 碳氮分配策略对氮利用效率的调控及其微生物潜在作用
本研究表明，岩生型的高氮利用效率并非由单一因素决定，而是其形态、生理与资源分配策略协同作用的结果。在资源分配上：一方面，在资源获取端，岩生型以显著高于林下地生型的单位根长吸氮量，在有限的石缝空间中高效捕获氮素；另一方面，在资源利用端，岩生型并未将获取的氮素主要用于合成富含氮的光合蛋白以追求快速生长（其叶片可溶性蛋白和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶活性均低于灌丛地生型），而是倾向于将碳同化产物用于构建富含碳的结构性物质以及支持维持性代谢，这直接体现在其最高的全株C/N上。这种“高获取、高储存、低消耗”的资源分配模式，使其能够用等量的氮素积累更多的生物量，从而实现了最高的氮利用效率。相比之下，灌丛地生型虽具备活跃的氮同化能力（高硝酸还原酶活性），但其将氮素更多地用于构建高氮的光合器官，导致C/N较低，氮利用效率也随之降低。上述形态与生理特征的差异，最终通过碳氮在器官间的差异化分配格局，决定了整体的氮利用效率。本研究发现，岩生型通过显著提高全株C/N，将吸收的氮资源更多地用于维持性储存与结构性成分合成，而非用于合成高氮含量的光合蛋白进行快速生长，这直接贡献于其最高的氮利用效率。采用C/N评估氮利用效率已被广泛认可（Huang et al., 2022; Zhang et al., 2023），较高的C/N通常意味着植物将碳相对于氮进行更大量的同化与储存，可反映更高的氮利用效率（周俊妞等，2020）。相关性分析及RDA结果进一步证实，氮利用效率与总根长、根的碳氮积累量及叶片碳氮比均呈显著正相关。
与已有研究相比，符裕红等（2020）对喀斯特地区根系地下生境优势植物的研究表明，多数植物通过增加根系生物量分配来提高养分获取能力；而本研究中岩生型硬叶兜兰则在维持较低根冠比的同时实现高效氮获取。与Feng等（2022）报道的附生兰“低叶片氮-高C/N”策略相比，岩生型硬叶兜兰的C/N更高，氮利用效率也更优，这可能与其岩生生境极端贫瘠且干旱胁迫频发有关。此外，与同属喀斯特分布的地生兰相比，岩生型硬叶兜兰的全株C/N甚至高于多数喀斯特地生兰（吴天柔等，2023；王琨，2023），这表明其代表了兰科植物在养分限制光谱上的一种极端适应类型。
值得注意的是，附生或岩生兰科植物与地生型的一个关键差异在于根际基质的质与量。岩生型缺乏真正的土壤环境，其根际微生物群落（包括与兜兰专性共生的真菌）在协助其从岩石表面、大气沉降和凋落物中获取和活化氮素方面可能扮演了比地生型更为重要的角色。虽然本研究未直接测定微生物群落，但前人研究已证实兜兰属植物与特定真菌形成共生关系（Feng et al., 2022），这些共生体可能通过固氮、有机氮矿化等方式弥补了岩生型生境中有效氮的不足，间接支持了其高氮利用效率。这一潜在机制有待未来研究重点揭示。本研究中土壤碱解氮含量与氮利用效率之间存在的负相关关系，也印证了植物在氮限制条件下通常具有较高氮利用效率的结论（耿雪琪等，2024）。
3.1.4 研究局限性与展望
需要指出的是，本研究的样本均来自相对集中的地理区域，虽然保证了生境可比性，但可能在一定程度上限制了结论的普适性。此外，对根际微生物群落及其功能的未定量分析是本研究的另一个局限。本研究在土壤样品测试分析中未设置无硬叶兜兰生长的裸地土壤作为对照，因此无法直接评估该物种对根际土壤氮素的实际影响程度（如氮素富集或耗竭效应）。这一局限可能影响对植物-土壤氮素互作关系的全面理解。后续研究可在相同微生境类型中增设无植株分布的裸地土壤为对照，并整合微生物组学技术，以更精确地量化硬叶兜兰不同生态型对土壤氮库的调控作用，更全面地揭示其氮适应的“植物-微生物”联合机制。
3.2 结论
本研究通过对同域分布的3种生态型硬叶兜兰进行系统比较，得出以下结论：（1）氮利用效率在生态型间呈现显著分化，而氮吸收效率无显著性差异。岩生型与林下地生型表现出相近且较高的氮利用效率，均显著高于灌丛地生型。这表明生态型间的适应差异主要体现于氮素同化与转化环节，而非吸收环节。（2）不同生态型在根系构型与氮代谢生理上形成了互补的适应特征。林下地生型依赖更大的总根长与更高的根冠比，以扩大土壤探索范围来获取氮素。岩生型则表现出最高的单位根长吸氮能力，并结合较高的植株碳氮比，实现高效的氮资源利用。灌丛地生型具备最强的硝态氮同化能力，表现为最高的叶片硝酸还原酶活性与叶氮含量，显示出活跃的硝态氮代谢途径。（3）碳氮分配格局与氮利用效率密切相关。氮利用效率与叶片碳氮比、根部碳积累量及总根长均呈显著正相关，而与土壤铵态氮含量呈显著负相关。冗余分析进一步表明，土壤硝态氮、铵态氮含量以及郁闭度和速效钾含量是驱动氮素利用性状分异的主要环境因子。综上，在统一的石灰岩贫氮生境下，硬叶兜兰的不同生态型通过调控根系形态、氮同化途径及碳氮资源配置，形成了多样化的氮适应模式。本研究从功能性状与生理整合的角度，阐明了该物种对喀斯特异质微生境的适应机制，为其针对性保育提供了理论依据。