云南樱花品种‘红霞’（Cerasus‘Hongxia’）（张琼，2013；王贤荣，2014）在昆明广泛种植，俗称“西府海棠”（俞德浚，1986），花期3月，半重瓣至重瓣，粉红色，其花序伞形，2~5朵簇生，盛开之际，满树繁英，一片灿烂，观赏价值较高。‘红霞’的首次记录为张琼（2013）的硕士论文，归属为红花高盆樱（Cerasus cerasoidesvar. rubea）种系的新品种：‘红霞’红花高盆樱（C. cerasoides var. rubea‘Hongxia’），论文中还记录了3月开花的新品种‘碧心’红花高盆樱（C. cerasoidesvar. rubea‘Bixin’）（图1）。但是，在《中国樱花图志》（王贤荣，2014）中，‘红霞’‘碧心’却被记录为高盆樱（C. cerasoides）的新品种：‘红霞’高盆樱（C. cerasoides ‘Hongxia’）、‘碧心’高盆樱（C. cerasoides ‘Bixin’）。此外，该书还记录了3月开花的高盆樱（C. cerasoides）新品种：‘春潮’高盆樱（C. cerasoides ‘Chunchao’）。

高盆樱即高盆樱桃（俞德浚，1986），又名“菁樱桃”“云南欧李”“喜马拉雅野樱桃”（Xu et al.，2018），分布于泛喜马拉雅地区，在我国以云南为天然分布中心，属云南省重点保护野生植物。高盆樱一般在12月份左右开花，花期可为1个月，是唯一在冬季盛开的樱花（张琼，2013；Xu et al.，2018），常被称为“冬樱花”（赵大克和郑丽，2009）。

而有关‘红霞’等3月开花的云南樱花重瓣栽培种质，其最早记录是在《中国植物志》（俞德浚，1986）中（图1），被认为是高盆樱桃变种——红花高盆樱桃的园艺品种，但是，品种名不详。但在2003年的Flora of China（Lu et al.，2003）中，红花高盆樱被归并到高盆樱中，花期为12月、3月。基于形态、花期的较大差异，张琼（2013）认为是否将红花高盆樱并入高盆樱，还是作为一个种或变种，均有待进一步研究。那么，归属于变种的‘红霞’等3月开花的重瓣品种，能否直接归属于原种高盆樱，还是归属其他种系？

近年来，核基因组内转录间隔区ITS和叶绿体间隔序列（petA-psbJ、trnH-psbA、rpl32-trnL和trnL-trnF）的测序分析结果记录了，红花高盆樱与钟花樱（C. campanulata）聚为姊妹群，而与高盆樱的亲缘关系较远（付涛等，2018）。SSR分子标记研究表明（Ma &Margaret，2005；张琼，2013；聂超仁等，2018），‘红霞’等3月开花的云南樱花重瓣品种聚在钟花樱种系，而不是高盆樱种系。这说明‘红霞’等品种的种系可能是钟花樱，而不是高盆樱。综上表明，‘红霞’等3月开花的重瓣云南樱花品种的种系存疑，对后期的品种分类和遗传育种等研究工作的开展极为不利。

与叶绿体间隔序列petA-psbJ等相比，叶绿体全基因组能够更为全面地揭示物种间的系统关系（王雪芹等，2021）。为此，本研究将以云南樱花品种‘红霞’为研究对象，对其开展叶绿体全基因组测序及分析，同时结合在细胞核层面的研究报道，进一步分析‘红霞’的种系归属，以期为‘红霞’等3 月开花的重瓣樱花品种的起源及演化提供科学依据，为云南樱花的研究和利用提供一定的参考资料。

1 材料与方法

实验材料为云南樱花品种‘红霞’（图2）的成熟健康叶片，采集地点位于云南省昆明市昆明理工大学呈贡校区（102.856 5° E、24.852 5° N）。

叶绿体DNA测序流程按照Illumina公司提供的标准方案进行，使用CTAB法（Doyle &Doyle，1987）提取基因组DNA，经检测合格后，用超声波将DNA片段化，然后对片段化的DNA进行纯化、末端修复、3′端加A、连接测序接头，再用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，采用全基因组鸟枪法策略，对DNA样品构建1个350 bp的文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina NovaSeq进行双末端测序，长度为150 bp。

高通量测序得到的原始图像数据文件经碱基识别（base calling）分析转化为5.1G的原始数据（raw reads），结果以FASTQ文件格式存储。原始测序数据经过低质量数据过滤得到5G的有效数据（clean reads）。使用的过滤软件为SOAPnuke V 1.3.0（https://github.com/BGI-flexlab/SOAPnuke），过滤标准如下：（1）去除N碱基含量超过5%的数据（reads）；（2）去除低质量（质量值小于等于5）碱基数目达到50%的数据（reads）；（3）去除有接头（adapter）污染的数据（reads）。

使用SPAdes V 3.13.0（https://github.com/ablab/spades/）软件进行基因组拼接，将拼接结果与近缘种高盆樱的叶绿体全基因组（MF621234）与给定的核酸序列与核酸数据库中的序列进行比对，基于比对情况并确定候选序列组装结果。连接好的序列，若包含gap（含N序列），则使用Gapcloser（Version: 1.12）进一步补洞，得到最终的拼接结果。利用专门针对叶绿体的注释软件CPGAVAS2 V 2.0（http://47.96.249.172:16019/analyzer/annotate/）进行基因注释后并绘图。测序后，使用Bankit将注释好的序列提交至NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），获得Genbank登录号：OP022428。

采用MISA V 1.0（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html/），使用默认参数对叶绿体进行SSR检测；并且对应的各个重复单元（unit size）最少重复次数分别为1-8、2-4、3-4、4-3、5-3、6-3，如1-8表示以单核苷酸为重复单位时，其重复数至少为8才可被检测到。

采用Geneious R10（Biomatters，Ltd.，New Zealand）软件从NCBI线上数据库下载樱属植物的叶绿体全基因组15个，分析“云南樱花”品种‘红霞’的系统位置和亲缘关系。以Malus prunifolia（KU851961）（Lu et al.，2003）为外类群。所有cp基因组序列均在Genious R10中采用MAFFT进行排列（align）。最后在RAxML V 8.0（Stamatakis，2014）中根据最大似然标准构建系统发育树，并使用1 000次重复自检（bootstrap）计算各分支支持率。

2 结果与分析

2.1 ‘红霞’的叶绿体基因组

通过组装，获得了完整的‘红霞’叶绿体全基因组，其叶绿体全长为157 832 bp，包含一对反向重复（inverted repeat sequence，IR，26 381 bp）区，由小单拷贝（short single copy，SSC，19 120 bp）区和大单拷贝（long single copy，LSC，85 950 bp）区间隔开来（表1），基因组的鸟嘌呤（Guanine）、胞嘧啶（Cytosine）含量为36.73%。‘红霞’叶绿体基因组共编码128个基因（图3），具体包括ATP合成酶（atpA、atpH、atpE、atpB、atpI、atpF）、RNA聚合酶（rpoA、rpoC2、rpoC1、rpoB）、阅读框（ycf）（ycf4、ycf1、ycf2、ycf3）、转移RNA（trnL-CAA、trnR-ACG、trnC-GCA、trnW-CCA、trnS-CGA、trnD-GUC、trnN-GUU、trnL-UAA、trnK-UUU、trnR-UCU、trnY-GUA、trnH-GUG、trnP-UGG、trnS-GGA、trnM-CAU、trnT-UGU、trnA-UGC、trnL-UAG、trnV-GAC、trnS-UGA、trnE-UUC、trnT-GGU、trnG-GCC、trnQ-UUG、trnF-GAA、trnS-GCU）、蛋白酶（clpP）、还原型辅酶Ⅰ（NADH）脱氢酶（ndhJ、ndhK、ndhE、ndhC、ndhF、ndhH、ndhG、ndhD、ndhI、ndhA、ndhB）、核糖体蛋白（LSU）（rpl2、rpl33、rpl23、rpl20、rpl22、rpl16、rpl14、rpl36、rpl32）、核糖体RNA（rrn4.5S、rrn16S、rrn23S、rrn5S）、细胞色素b/f复合物（petB、petL、petN、petG、petD、petA）、RubisCO大亚基（rbcL）、成熟酶（matK）、光系统I（psaI、psaA、psaB、psaJ、psaC）、核糖体蛋白（SSU）（rps2、rps11、rps3、rps8、rps16、rps19、rps15、rps4、rps12、rps14、rps7、rps18）、光系统Ⅱ（psbM、psbH、psbI、psbE、psbC、psbJ、psbZ、psbL、psbK、psbA、psbN、psbB、psbT、psbD、psbF）、其他基因（accD、cemA、ccsA）。

此外，共检测到‘红霞’叶绿体基因组的SSR序列247个（图3），包括163个复杂重复序列（绿色短杆）和84个简单重复序列（其中两碱基重复序列73个，黑色短杆；四碱基重复序列10个，黄色短杆；六碱基重复序列1个）。

叶绿体基因组图谱的内圈为MISA（V.1.0）识别的微卫星序列，外圈是用CPGAVAS2（V.2）绘制，显示质体上的基因结构，基因的颜色根据它们的功能分类来区分。

The inner circle of chloroplast genome map is the microsatellite sequence identified by MISA （V.1.0）, and the outer circle is drawn by CPGAVAS2（V.2）, showing the gene structure on the plastid genome. The color of genes is distinguished according to their functional classifications.

2.2 ‘红霞’叶绿体基因组的系统分析

通过构建樱属16个叶绿体全基因组的最大似然法系统发育树（图4）。图4结果显示，大叶早樱（MN695296）、日本樱花（KP732472）聚为姊妹群（支持率为96%）。‘红霞’与上述姊妹群聚为一支，又与蜜腺樱桃（Cerasus discadenia）聚为一支，并且均获得了100%的支持率。大叶早樱+日本樱花+‘红霞’+腺蜜樱桃和高盆樱+红毛樱桃（C. rufa）虽聚为姊妹群，但获得的支持率仅为37%。由此可见，‘红霞’和大叶早樱、日本樱花的亲缘关系最近，而与高盆樱的亲缘关系较远。

通过叶绿体全基因组的序列比对，发现‘红霞’与高盆樱（ID：MF621234）的叶绿体全基因组DNA相似率仅为89.1%，而与近缘种钟花樱叶绿体基因组DNA（MH491529）的相似率则为89.4%，均低于‘红霞’与大叶早樱叶绿体基因组DNA（MN695296）的相似率（89.8%）。由此可见，与‘红霞’亲缘关系最近的物种并不是高盆樱。

综上认为，3月开花的云南樱花品种‘红霞’可能不是高盆樱（12月开花）的品种。

3 讨论

3.1 基于叶绿体全基因组的‘红霞’品种溯源

本研究中，曾被认为是变种红花高盆樱（俞德浚，1986）的品种‘红霞’，其叶绿体全基因却与高盆樱的亲缘关系较远，这与前人的研究结果（‘红霞’等品种均不聚在高盆樱种系）（张琼，2013；付涛等，2018；聂超仁等，2018）一致。从形态特征来看，‘红霞’的萼筒宽钟形、萼裂片宽卵状三角形、先端突尖、先叶开放、3月开花等特征，与高盆樱的“萼筒钟形、萼裂片三角形、先端急尖、花叶同放、10—12月开花”有显著的差异（俞德浚，1986；张琼，2013）。‘红霞’等品种的树体、叶片和花朵，常显著大于高盆樱。因此，‘红霞’的种系可能并不是高盆樱，两者可能有不同的起源。

在我国的植物标本库中，仅有一份关于红花高盆樱的标本记录[KUN 1312617（cvh.ac.cn）]，采集地点在云南沧源县勐董镇的坝卡山顶，所述的采样时间是2010年3月29日，标本的果实已完全成熟，果实成熟期与‘红霞’的花期基本一致。因此，这一标本的花期可能是在冬季，极有可能是高盆樱原种。尽管如此，‘红霞’等3月开花的云南樱花重瓣品种是否可以直接归属于高盆樱，今后仍可前往上述标本采集点进行实地考察，进一步从形态和分子等水平展开深入的研究。

同时，本研究中，‘红霞’与钟花樱的亲缘关系也较远；而在我国南方野生樱属植物的系统发育分析中，红花高盆樱和同为细齿组的钟花樱等关系较近（付涛等，2018）。本研究中，‘红霞’和钟花樱的亲缘关系差异较大，主要原因可能是基于叶绿体全基因组构建的最大似然法系统发育树；而付涛等（2018）是利用细胞核ITS+4段叶绿体组合序列构建的系统发育树，两者结果不完全相同。此外，采样存在的差异也可能导致结果不一样。

从形态特征来看，‘红霞’的萼裂片宽卵状三角形、先叶开放、3月开花等特征，与钟花樱更为接近（俞德浚，1986），这与细胞核层面的分子研究结果（‘红霞’‘碧心’均聚在钟花樱种系）（张琼，2013；付涛等，2018；聂超仁等，2018）一致。而在叶绿体基因组层面，‘红霞’和大叶早樱、日本樱花的亲缘关系最为相近。因此本研究推测，‘红霞’等3月开花的重瓣品种可能是钟花樱和日本早樱或大叶早樱的杂交品种，甚至可能是杂交多倍化形成的异源多倍体。因为在大多数植物中，叶绿体基因属于母性遗传，所以如果‘红霞’的品种起源涉及杂交事件的话，杂交母本最有可能是大叶早樱或日本樱花，而杂交父本最有可能是钟花樱。但是，上述推测还需要进一步的细胞学、分子生物学等证据来进行验证。

3.2 高盆樱（冬樱花）的栽培种质亟待整理

《植物名实图考》（吴其濬，1848）中记载：“冬海棠生云南山中，园圃中亦植之，树如山桃，叶似樱桃而长，冬天开桃色花······”。由此可见，高盆樱在云南的栽培历史悠久。近30年来，高盆樱在园林中的栽培与日俱增，对提升亚热带地区的冬季景观发挥了非常重要的作用，得到了人们的普遍认可和关注。目前，高盆樱已被引种至全国多地乃至东南亚栽培，可见，高盆樱的国际化已拉开序幕、势在必行。

高盆樱的栽培种质正逐渐增多，如云南万家红园艺有限公司报道的“重瓣冬樱花”（13~15瓣）和3个品种‘仙女散花’‘翡翠’‘冬之舞’；沈鑫等（2019）报道的高盆樱品种‘改良’和‘重瓣’；大理鹤庆县报道的“小阳春”；李秀琴（2018）报道的“重瓣冬樱花”；安宁市报道的“滇鹤红樱”；谢凤云等（2017）报道的“粉冬樱花”“绿冬樱花”“重瓣冬樱花”“新品冬樱花”；杨晓东（1992）等报道的“石屏冬樱花”等。这些栽培种质的花瓣有单瓣、重瓣和复瓣；花色有白色、粉红色、玫红色；花萼有绿色、红色，为高盆樱的品种分类提供了多样的性状。

然而，根据《国际栽培植物命名法规》（《International Code of Nomenclature for Cultivated Plants》，ICNCP，第八版）（靳晓白等，2013），部分品种名称的规范性还有待提升，如‘改良’‘重瓣’等。双引号标注的“滇鹤红樱”等，也只能视为俗称，如要称为品种，应选用单引号。此外，虽然各栽培群体从本地移栽的优良野生类型越来越多，但这部分栽培种质却没有规范的品种名称。

因此，高盆樱栽培种质在形态、细胞和分子水平的遗传多样性亟待开展系统的研究，分析其杂交或多倍化事件，进而系统整理高盆樱的栽培品种，提出符合ICNCP的品种名录和基于种系的分类系统，为高盆樱的遗传育种研究、品种鉴定与分类、国际化应用等提供重要的基础资料。

3.3 钟花樱的分类地位

钟花樱曾被认为是高盆樱分布区偏东、低海拔地区的变种（朱淑霞等，2019）。虽然钟花樱和高盆樱在滇东南周边有一定的重叠分布，但Flora of China（Lu et al.，2003）和付涛等（2018）将高盆樱和钟花樱认定成两个种。高盆樱与相似分布区的红毛樱桃（Cerasus rufa）聚为姊妹群，亲缘关系最近，而与钟花樱的亲缘关系较远。从叶绿体全基因组的系统关系分析来看，本研究认为钟花樱单独成种更为合理，而不是作为高盆樱的变种。

参考文献