花香化合物是植物花朵释放的次生代谢物，在植物中表现出明显的多样性，一种植物中存在十几种甚至上百种挥发物质。普遍认为花香物质有引诱传粉者、提供食物源信号、抵御昆虫和病原体侵害等功能（Dobson，1994；Shulaev et al.，1997；孔莹等，2012）。花香作为“花卉的灵魂”，现已有2 000多种花香物质从90个属991种植物类群中被鉴定出来（Jette et al.，2006）。国内外已开展大量芳香植物育种工作，如育成四季开花、芳香浓郁香花月季群（李晋华等，2018）；培育具有香味的常绿杜鹃品种（Ashworth et al.，2003）；培育出30余个适宜北方陆露地栽培的梅花香花品种（陈俊愉等，1995；赵靓，2019）；此外，山茶也相继培育出芳香品种（范正琪等，2014）。随着蝴蝶兰鲜切花和盆栽蝴蝶兰市场的发展，以及人们对芳香植物的喜爱，香型蝴蝶兰市场的需求扩大，培育不同香型的蝴蝶兰品种将成为未来重要的育种方向。

肖文芳等（2020，2021）鉴定得到大叶蝴蝶兰（Phalaenopsis violacea）中的单萜类和倍半萜类物质居多发现，并特征香气物质榄香素；之后，以4个蝴蝶兰品种花朵挥发性成分进一步验证单萜类化合物是蝴蝶兰花朵的主要致香成分。在对兰花花香成分差异比对时发现，蝴蝶兰中醇类物质在数量和相对含量上占优势（彭红明，2009；杨慧君，2011）。浓香型原生种荧光蝴蝶兰（P. bellina）和大叶蝴蝶兰花香由芳樟醇和香叶醇及其衍生物等单萜类化合物决定（Hsiao et al.，2006，2008）。杨淑珍和范燕萍（2008）在检测2个品种挥发性成分时推测，L-沉香醇为香气物质的主要成分。原生种西蕾丽蝴蝶兰（P. schilleriana）中挥发性成分主要为萜烯类和酯类物质，包含乙酸橙花酯、橙花醇、香茅醇及乙酸香茅酯（Awano et al.，1997）。

现代蝴蝶兰种质资源丰富，从常绿到落叶、大花型到小花型均有，传统杂交育种受到遗传背景、基因组倍性、杂交亲和性等制约，香花育种进程缓慢，市场中鲜有香花品种流通。不同物种间或同一物种不同品种间花香组分仍有差异，并且目前对不同蝴蝶兰品种挥发性成分的研究相对较少，主要针对少数的原生种及商业品种，检测出的特征香气相对单一，未能通过挥发性物质对品种类群进行分类。因此，本研究采用顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用（GC-MS）的芳香植物香气收集分析方法，系统地对栽培的8个香花蝴蝶兰新型杂交品种在盛花期时的香气成分进行全面分析，旨在深入了解不同蝴蝶兰品种花朵的香味组分及其含量，并以花香成分为基础进行聚类分析，区分香味特征各异的品种群体，为芳香蝴蝶兰种质资源梳理、特定香味品种选育及产品加工生产等进一步研究与开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

供试材料：F1（Phalaenopsis ‘Nobby’s Doctor’× Phalaenopsis ‘Yaphou Yellow Story’）、F2（Phalaenopsis ‘Samela Blue’×Phalaenopsis speciosa）、F3（Phalaenopsis speciosa ‘Jiaho Spot SM/TOGA 82P’）、F4（Phalaenopsis ‘Super Zebra’）、F5（GS 032）、F6（Phalaenopsis speciosa ‘Purple Pixie’）、F7（Phalaenopsis speciosa×sib）、F8（Phalaenopsis ‘Yaphon Christmas Red Spots’）8个香花蝴蝶兰新型杂交品种，均取自福建农林大学森林兰苑温室大棚，期间正常水肥管理。各挑选3株盛花期且长势一致的盆栽苗，于测试前1 d搬至样品前处理室，以适应环境条件。于12月22—30日10：00—14：00期间摘取盛开7 d的鲜花进行测定，每个样品取3个生物学重复样本。

仪器：手动SPME进样器和50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头（美国 Supelco 公司）；Agilent 7890B GC-5977B MS和Agilent的HP-INNOWAX（60 m × 0.25 mm × 0.25 μm）色谱柱。

1.2 方法

1.2.1 HS-SPME萃取

取样前将固相微萃取头在气相色谱进样口老化30 min，老化温度250℃。摘取盛花时期蝴蝶兰花朵样品，整朵撕开，置于垫片密封的25 mL萃取瓶中，加入1 μL含0.1%癸酸乙酯的甲醇（色谱级）溶液为内标，将老化好的萃取头插入样品瓶顶空部分，萃取纤维位于样品上方1 cm处，固定手柄，顶空瓶置于35℃水浴条件下吸附30 min。

1.2.2 GC-MS分析

吸附完成后将固相微萃取头抽回，插入气相色谱-质谱联用仪进样口，250℃下解析5 min，启动仪器采集数据。色谱条件：采用HP-INNOWAX色谱柱，长60 m、内径0.25 mm、液膜厚0.25 μm；载气为高纯度氦气（99.99%），不分流模式进样，隔垫吹扫流速为3 mL·min^-1，柱流速为1 mL·min^-1。程序升温：进样口温度250℃，柱温起始温度45℃下保持1 min，先以5℃·min^-1升至200℃，再以15℃·min^-1升至250℃。质谱条件：传输线接口温度维持在250℃，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，电离方式为EI，电子能量参数70 eV，发射电流为200 μA。以扫描方式获得质谱数据，检测质量扫描范围（m/z）为20~500 amu，溶剂延迟时间为3 min。

1.2.3 数据分析

香味组分经气相色谱分离形成各自的总离子流色谱图，解析各个峰所对应的质谱图。将所得到的质谱数据与计算机谱库NIST17标准库检索及资料进行比对，按相似度最高原则结合网站对应物质所列举的相关文献确定样品中的挥发性化学成分。根据离子流峰面积归一化法，计算各组分在总挥发物中的相对含量且进行定量分析。每个样品分别进行3次平行重复试验。利用软件Excel 2010整理汇总数据且制作图表，主成分分析、聚类分析及偏最小二乘分析运用软件Origin Pro 2019b、Metabo Analyst 5.0进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 不同蝴蝶兰品种花香成分及其相对含量

8个蝴蝶兰品种中共检测出96种挥发性成分（表1），虽然不可避免地在不同品种中测出相同的香气物质，但每个品种都因挥发性成分不同比例的相互组合而表现出独特的花香特征。成分乙酸甲酯在各品种中均被检测出来，相对含量差异很大。乙酸甲酯物质在F1、F5和F7中含量较高，分别为24.69%、14.07%和17.05%，推测物质乙酸甲酯为3个品种的主要香气成分之一。

萜烯类组分的相对含量在蝴蝶兰中具有重要地位，不同品种的蝴蝶兰所检测出的萜烯类物质具有较大差异。6个蝴蝶兰品种F1、F2、F3、F4、F6和F7中均检测出倍半萜物质α-香柑油烯，物质释放均为高表达，推测它是6个品种的主要香气之一。β-红没药烯在F3和F7中较高表达，含量可达12.99%和11.4%，推测β-红没药烯是F3和F7的特征香气成分之一。在F2、F3、F6和F7中均检测到β-香柑油烯，在F3和F6中其相对含量均高于5%，推测此物质是4个品种中的花香主要香气之一。单萜类物质芳樟醇是F1、F2、F4、F5和F8的共有成分，在F5中相对含量最高，为16.81%，在F4和F1中相对含量较高，分别为8.94%和8.52%，推测它是这3个品种的主要香气之一。桉叶油醇是F1、F2和F8的共有成分，在F8中的相对含量检测最高为23.65%，在F2中检测次之为6.68%，在F1中仅检测出2.01%的相对含量，其余5个品种中未检测到，推测桉叶油醇是F2和F8的主要香气之一。桧烯在F8和F1中较高表达，相对含量分别为13.24%和6.78%，推测桧烯是构成F1和F8花香的主成分之一。在F5中检测到（3E）-4，8-二甲基壬-1，3，7-三烯，相对含量为6.4%，判定其为F5的香气主成分之一。此外，在F2中还检测到特有成分倍半萜物质（+）-白菖油萜，在F8中检测到特有成分单萜类物质（-）-α-蒎烯和（-）-β-蒎烯，在F5中检测有单萜物质罗勒烯及别罗勒烯，在F7中检测有反式-β-金合欢烯，F2中较多杜松烯及其相关产物。

续表1

续表1

6 个蝴蝶兰品种中，F1、F2、F3、F4、F5和F8中均检测出微量1-己醇，F1、F3、F4、F5、F7和F8中检测出微量反-3-己烯-1-醇，3-己烯-1-醇在F2和F4中相对含量为1.64%和0.13%，推测3-己烯-1-醇是F2中醇类组分之一。

2.2 不同蝴蝶兰品种挥发性成分的组分比较

从8个香花蝴蝶兰新型杂交品种盛花时期花朵GC-MS总离子流色谱图中，分析得到萜烯类、醛类、酯类、醇类、酮类、醚类、酚类和芳香族化合物8类物质。在不同蝴蝶兰品种中，主要挥发性物质在数量和相对含量上具有较大差异。8个蝴蝶兰种质资源中检测鉴定出的物质数量依次为22、35、26、10、20、31、21和31，其总相对含量依次为91.45%、88.65%、98.14%、90.94%、67.48%、98.55%、97.03%、86.65%，萜烯类数量相对其他组分较高，分别为14、26、15、5、9、15、9、24（表2）。不同蝴蝶兰的花香组成存有差异，每种植物的挥发性成分与含量都不相同，本研究中各品种的萜烯类物质种类数量占有最多且相对含量最高，是蝴蝶兰花朵中的主要挥发性成分。

扣除标品物质后，8个蝴蝶兰品种中均检测出萜烯类物质、酯类物质和醇类物质，各组分间相对含量差异较大。萜烯类物质作为蝴蝶兰花香的主要类别，F3和F6中相对含量较高，分别为80.69%和79.96%；F2、F7、F8中，相对含量分别为70.72%、68.56%、65.02%；F1、F4、F5中，相对含量较低，分别为45.06%、39.64%、31.72%。醇类物质在各品种中检测相对含量均较低，F2、F5和F4中相对含量分别为1.85%、1.25%和1.2%，F3中仅占0.23%。F1中的酯类物质检测相对含量最高，为29.09%；F5和F7次之，分别为18.61%和18.14%；F4中的相对含量最少，为4.26%。F2、F3、F6和F7中均检测出酮类物质和醚类物质，F2、F6和F7中检测有酚类物质，F2、F6和F8中检测有芳香族化合物，F2和F6中除醛类物质的其他组分外均检测出有效物质，F5中除共有组分外仅检测有醛类物质（图1）。

2.3 不同蝴蝶兰品种花香主成分聚类分析

不同品种的96种物质的主成分分析表明，品种与挥发性成分具有关联，并能在一定程度上确定挥发物中的致香成分。桉叶油醇、月桂烯等物质对PC1为正影响，α-香柑油烯、β-香柑油烯、香叶基丙酮、4-甲基苯甲醚等对PC1为负影响；β-古巴烯、榄香烯、（+）-白菖油萜、苯乙醇等物质对PC2为正影响，芳樟醇、香茅醇等对PC2为负影响。

据此，根据主成分的不同8个蝴蝶兰品种被划分在3个象限中，F2中挥发性成分种类和数量均最多，萜烯类物质主要是桉叶油醇、α-香柑油烯、芳樟醇、（+）-白菖油萜；F1、F4、F5和F8分为一组，不含酮类、醚类、酚类物质，挥发性成分种类最少，萜烯类物质主要是芳樟醇；F3、F6和F7分为一组，α-香柑油烯含量最高，还包含香叶基丙酮、4-甲基苯甲醚等其他挥发性成分种类（图2：A）。以8个蝴蝶兰品种的96种挥发性成分为基础，用数字0和1表示某一挥发性物质成分的有无，含有此种挥发性成分的数据赋值为1，没有或未检测即赋值为0（林榕燕等，2016），利用软件OriginPro 2019b聚类功能将8个蝴蝶兰品种分为3类，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类（图2：B）。遗传距离在6.39附近第一次分支，Ⅰ类中仅包含F2 1个品种；在5.87附近时第二次分支，Ⅱ类由F1、F4、F5和F8组成；Ⅲ类由F3、F6和F7组成。遗传距离越小，品种间的遗传关系越近。聚类分析与主成分分析一致将8个品种划分为同样的3大类，挥发性物质成分可能作为潜在特征标记物质区分不同品种群体，鉴别蝴蝶兰品种的亲缘关系，梳理蝴蝶兰芳香种质资源。

2.4 不同蝴蝶兰品种主要差异物质及其品质分析

对鉴定出的96种物质进行偏最小二乘（PLS-DA）分析，对8个蝴蝶兰品种可以依据绝对回归系数的加权值筛选出的主要差异物质分离开来。将筛选出的加权系数较大的前15个花香物质列为主要差异物质，对其气味类型及其品质进行确定。加权系数大于20的物质有5个，加权系数大于10的物质有10个。其中，α-香柑油烯的加权和值最高，为68.725。α-香柑油烯作为最主要差异物质，贡献率最高，在F3、F6和F7中的表达量较高；β-红没药烯、4-甲基苯甲醚、α-姜黄烯等其他4个差异物质表达量在3个品种中表达均较高，整体呈现木质型气味类型。F1、F4、F5、F8和F2中的花香物质成分气味较为繁杂，有薄荷型、木香型、清香型和果香型之分，按差异物质芳樟醇贡献率能够将5个品种分为两类，即F1、F4、F5和F8中具有玫瑰花香的物质释放较多，F2中玫瑰花香的芳樟醇成分表达较少（图3）。主要差异物质按香气类型可分为木香型、花香型、发酵香型、薄荷香型、清香香型、果香型和草药香型7种，其中有6种物质呈现木香型类型，气味品质更具层次变化（表3）。香气物质可以依据香气品质类型，按贡献率判断关系，区分香味特征各异的各个品系。

注： — 代表未检测出该类物质。下同。

Note： — means that the substance is not detected. The same below.

3 讨论与结论

花香是植物的天然产物，即使检测出相同的香气成分，每一个品种也可表现出独特的花香特征。与前人研究结果一致，8个蝴蝶兰品种盛花期花朵96种挥发性物质中，萜烯类物质的数量及相对含量较多，是蝴蝶兰挥发性物质的主要组分（Hsiao et al.，2008）。花香香味的形成依靠各种挥发物的相互作用，其香型主要由拥有较高气味值的挥发物决定。肖文芳等（2021）发现，蝴蝶兰8个品种的挥发性成分、相对含量和气味品质差异较大，已有报道的芳樟醇、沉香醇、香叶醇等挥发性成分除外，本研究中新检测出桉叶油醇和α-香柑油烯。芳樟醇存在于多种植物的挥发油中，在各种香型的香精配方中占有重要地位。本研究发现，在所测定的8个蝴蝶兰品种中，有4个蝴蝶兰品种的花香香味是由带有玫瑰花香的芳樟醇决定的，包括F1、F4、F5和F8；F3、F6和F7中木质型芳香由α-香柑油烯决定；F2为复合型花香，由桉叶油醇、α-香柑油烯、芳樟醇等物质共同提供。深度挖掘不同香型的香花品种，将花香成分进行合理的归类，形成物种特异性，为进一步有效开发利用花香物质、培育具有不同香味的蝴蝶兰新品种甚至是兰科蝴蝶兰属的新品种提供新的思路。

花香代谢产物作为生物体表型的重要性状之一，其形成具有多样性，对芳香植物的相关研究近年来已成为热门领域（孔滢等，2012）。花香成分繁杂多变，遗传机理复杂，植株个体受到亲本遗传的影响，选育的后代出现性状分离，可能是引起后代花香形成具有差异的主要原因之一。此外，香气变化还受到多种因素的影响，如细胞结构、内源物质的量、物质挥发效率以及物质释放方式等。细胞结构及细胞内含物影响花香物质累积与释放，在释放到细胞外前，花香物质以各种形式存在于细胞内，内源物质是其挥发的基础（EL-Sharkawy et al.，2005）。不同类型的物质释放到细胞外的方式有所不同，花香物质释放到细胞外的转运蛋白及相关酶发挥的作用机理还需要进一步探究。原生蝴蝶兰种质丰富，接近一半的原生种均具有香气特征，传统杂交技术制约香花育种进程。随着花香分子生物学的研究进展，分子育种已成为改良植物花香的重要途径（Jadaun et al.，2017）。通过对植物花香化合物的代谢产物、主要代谢途径及合成关键酶和基因的研究，可更直观有效地了解生物学过程及其形成机理，通过导入外源基因或阻断其相关代谢途径来进行花香遗传改良，从而打破芳香植物育种的种种限制，为解释蝴蝶兰不同品种花香的多样性，理解蝴蝶兰花香物质合成及定向育种目标的高效实现奠定基础。

参考文献