-
牡荆（Vitex negundo var. cannabifolia）是马鞭草科牡荆属植物，分布于中国华东各省及广西、广东、河北、贵州、四川等地，其叶具有解表化湿、祛痰平喘等功效（《全国中草药汇编》编写组，1996；国家药典委员会，2020）。牡荆主要成分为酚酸、黄酮、木脂素和萜类等化合物。现代药理研究表明，牡荆具有抗氧化、抗炎镇痛、抑菌、抗肿瘤等生物活性（舒柄垚等，2020）。抗氧化是牡荆的主要生物活性之一，向蓉等（2021）研究表明牡荆水提取物和醇提取物均具有一定的抗氧化活性，其中酚酸和黄酮类物质是其主要活性成分。Hu等（2015）研究上证实大部分酚酸类物质具有较强的2，2′-联氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）自由基清除活性。然而，其抗氧化活性药效物质基础尚不明确，并且未将指纹图谱结合生物活性进行质量控制评价研究。
-
谱-效关系研究是将药用植物的指纹图谱与其药效结果相结合起来，通过建立“谱-效”数学模型来反映中药的内在品质，其广泛应用于药用植物内在质量控制评价研究（王勤等，2017；晏朝操和张建峰，2020）。HPLC具有灵敏度高、分离度和重现性好、高效快速、应用范围广等特点，目前已成为色谱指纹图谱研究的首选方法，而电化学检测法（electrochemical detection，ECD）通过测量物质的电信号变化，可选择性地检测具有氧化还原性质的化合物，如带有硝基、巯基、酚羟基等基团的有机化合物。因此，可用HPLC-ECD筛查药用植物的抗氧化活性成分（罗敏等，2020; Zhang et al.，2021）。目前，谱-效关系研究的分析方法众多，其中灰度关联分析法（gray relational analysis，GRA）能够分析共有峰峰面积的变化与药效指标的变化趋势，偏最小二乘回归分析法（partial least square regression analysis，PLSR）对于系统的信息和噪声更易于辨别，可以弥补灰度关联分析法中关联度均为正值所带来的分析误差（刘晓燕等，2020）。因此，常将GRA和PLSR相结合应用于谱-效关系分析研究。
-
本研究收集18批不同来源的牡荆叶样品，采用HPLC-ECD和体外抗氧化活性评价方法，通过建立HPLC-ECD指纹图谱且结合样品含量测定、系统聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和谱-效关系分析，拟探讨以下问题：（1）牡荆叶的化学成分及其含量；（2）牡荆叶不同化学成分对抗氧化活性的贡献。
-
1 材料与方法
-
1.1 材料
-
1.1.1 药材与试剂
-
新鲜牡荆叶样品采自广西、广东和河北，按照2020年《中国药典》中牡荆叶的鉴定要求，经遵义医科大学孟令杰博士鉴定为马鞭草科牡荆属牡荆（Vitex negundo var. cannabifolia）的叶，其详细信息见表1。新鲜牡荆叶于40℃下烘干后，分别粉碎并过50目筛，放置在4℃条件下保存备用。
-
原儿茶酸、绿原酸、木犀草苷、没食子酸、奎诺二甲基丙烯酸酯（Trolox）（阿拉丁生化科技股份有限公司，批号分别为K1717091、J1523050、10122401、L1810248、A2010059，纯度≥97%）；荭草苷、异荭草苷、新绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C（成都普菲德生物技术有限公司，批号分别为20031202、20052201、19042305、20032601、20032602、20080802，纯度≥98%）；异牡荆素 （上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号为ST09650120，纯度≥ 98%）；芦丁（国药集团化学试剂有限公司，批号为2016092，纯度≥95%）；甲醇、乙腈均为色谱级，均购自北京伊诺凯科技有限公司；其余试剂均为分析纯。
-
1.1.2 仪器
-
Thermo UltiMate3000 bio-RS型HPLC仪，检测器为ECD-3000 RS；Sorvall ST8R型高速离心机（美国赛默飞世尔科技有限公司）；SpectraMax i3x型多功能酶标仪[美谷分子仪器（上海）有限公司]；ME104E型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；Purelab Chorus 2型纯水超纯水系统（英国埃尔格公司）；GZX-9070MBE型电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。
-
1.2 方法
-
1.2.1 标准品溶液的制备
-
精密称取原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、荭草苷、异荭草苷、异牡荆素、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C适量，用甲醇溶解制成2 mg·mL-1的标准品储备液，于-20℃下冷冻保存以备用。
-
1.2.2 供试品溶液的制备
-
分别精密称取不同批号的牡荆叶样品，以80%甲醇为溶剂，按1∶30 （g·mL-1）的料液比在25℃下超声提取30 min，于9 000 r·min-1条件下离心5 min，取上清液加80%甲醇按1∶1等体积稀释混匀，过0.22 μm有机滤膜即制得供试品溶液。
-
1.2.3 色谱条件
-
XBridge BEH Shield RP18色谱柱（3.0 mm × 150 mm，2.5 μm）；流动相乙腈（A）-甲酸铵柠檬酸混合溶液（B）（25 mmol·L-1甲酸铵溶液和25 mmol·L-1柠檬酸溶液以1∶1等体积混匀，用甲酸调pH至2.6）梯度洗脱（0~9.5 min，5% → 7.5% A; 9.5~12.5 min，7.5% → 12% A; 12.5~30 min，保持12% A; 30~40 min，12% → 19% A; 40~48 min，保持19% A; 48~53 min，19%→ 45% A; 53~55 min，45%→80% A）；ECD检测电压700 mV；流速0.6 mL·min-1；柱温45℃，样温12℃；进样量1 μL。
-
1.2.4 总酚、总黄酮含量测定及体外抗氧化实验
-
1.2.4.1 总酚含量测定
-
参照Dżugan等（2018）的方法并稍作修改，先吸取250 μL供试品稀释液（加80%甲醇稀释40倍）和250 μL 0.25 mol·L-1 Folin酚试剂混合静置3 min后，加入500 μL 15% Na2CO3溶液混匀后暗反应30 min，离心取上清液于酶标仪760 nm处测定吸光度。以没食子酸溶液为标准，所有样品测量结果均以没食子酸当量（mg·g-1）表示。没食子酸标准品与吸光度值的回归方程为y=0.014 2x+0.062 5，R2= 0.998 8。
-
1.2.4.2 总黄酮含量测定
-
参照He等（2015）的方法并稍作修改，先吸取500 μL供试品稀释液（加80%甲醇稀释5倍）、1 000 μL 80%甲醇、250 μL 5% NaNO2 溶液，混匀放置6 min后，再加入250 μL 10% Al（NO3）3溶液，混匀放置6 min后，又加入2 000 μL 4% NaOH溶液，混匀放置15 min后，于酶标仪510 nm处测定吸光度。以芦丁溶液为标准，所有样品测量结果均以芦丁当量（mg·g-1）表示。芦丁标准品与吸光度值的回归方程为y=0.000 9x + 0.046 0，R2=0.999 2。
-
1.2.4.3 铁离子还原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）测定
-
参照王金梅等（2017）的方法并稍作修改，分别吸取供试品稀释液（加入80%的甲醇稀释60倍），加入80%的甲醇至100 μL后，加入300 μL TPTZ工作液混匀反应，5 min后于酶标仪593 nm处测定吸光度。以Trolox溶液为标准，所有样品测量结果均以Trolox当量（mg·g-1）表示。Trolox标准品与吸光度值的回归方程为y=0.019 2x + 0.022 2，R2=0.996 9。
-
1.2.4.4 DPPH自由基清除实验
-
参照Zhang等（2015）的方法并稍作修改，分别吸取80 μL的供试品稀释液（加入80%的甲醇稀释20倍），加入80%的甲醇至200 μL后，再加入DPPH自由基母液[DPPH∶80%甲醇=1∶10（mg·mL-1）]400 μL，摇匀，暗反应10 min后，于酶标仪517 nm处测定吸光度。以80%甲醇为空白组，不同浓度的Trolox溶液为对照组。所有样品测量结果均以清除率表示，清除率计算公式：
-
1.2.4.5 ABTS 自由基清除实验
-
参照Aati等（2018）的方法并稍作修改，分别吸取100 μL的供试品稀释液（加入80%的甲醇稀释30倍），加入200 μL的ABTS工作液，混匀暗反应20 min后，于酶标仪734 nm处测定吸光度。以80%甲醇为空白组，不同浓度的Trolox溶液为对照组。所有样品测量结果均以清除率表示，清除率计算公式：
-
1.2.4.6 氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）测定
-
在供试品溶液中加入磷酸盐缓冲溶液稀释500倍得到供试品稀释液，实验步骤参照徐维盛等（2014）的方法，每隔5 min测定一次荧光强度，总时间为3 h。以磷酸盐缓冲溶液为空白组，不同浓度的Trolox溶液为对照组。所有样品测量结果均以Trolox（mg·g-1）表示，具体计算公式表示为式（3）和式（4）：
-
式中：AUC为荧光衰退曲线下面积；fn为第n个测定点的相对荧光强度；△t为测定荧光强度的时间间隔。
-
Trolox标准品与净荧光衰退曲线下面积（AUCTrolox-AUC空白组）的回归方程为y=1.368 0x + 8.301 9，R2=0.994 6。
-
1.2.5 数据处理与分析
-
采用Excel 2013软件进行数据处理和灰度关联分析；采用SPSS 26软件进行皮尔逊相关分析和系统聚类分析；采用SIMCA 14.1软件进行PLSR分析。色谱图和PLSR结果通过Origin 2021软件进行绘制。
-
2 结果与分析
-
2.1 指纹图谱方法学考察
-
2.1.1 精密度试验
-
取牡荆叶（批号为S2），按“1.2.2”项下方法制备成供试品溶液，于“1.2.3”项的色谱条件连续进样6次，21个共有峰保留时间的RSD≤0.45%，峰面积的RSD≤1.31%，这说明试验方法符合分析检测要求。
-
2.1.2 重复性试验
-
取牡荆叶（批号为S2），按“1.2.2”项下方法制备成6份供试品溶液，于“1.2.3”项的色谱条件下进样分析，21个共有峰保留时间的RSD≤1.72%，峰面积的RSD≤4.81%，结果表明试验建立的方法重复性较好。
-
2.1.3 稳定性试验
-
取牡荆叶（批号为S2）按“1.2.2”项下方法制备成供试品溶液，在“1.2.3”项的色谱条件下分别于0、4、8、12、16、18、24 h进样分析，21个共有峰保留时间的RSD≤0.58%，峰面积的RSD≤3.94%，结果表明24 h内稳定性较好。
-
2.2 HPLC-ECD指纹图谱的建立及共有峰指认
-
分别取18批牡荆叶，按照“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，同“1.2.3”条件测定并记录色谱图和总峰面积，将色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》，以S8为参照图谱，生成牡荆叶HPLC-ECD指纹图谱（图1）、混合标准品图（A）和对照指纹图谱（B）（图2）。通过多点校正和Mark峰匹配得到21个共有峰，其中峰1、2、5、8、9、11、12、14、15、17分别为原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、荭草苷、异荭草苷、异牡荆素、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C。计算其与对照指纹图谱的相似度，相似度结果为0.816~0.983，样品S1-S18的相似度分别为0.843、0.983、0.967、0.959、0.953、0.916、0.969、0.966、0.968、0.980、0.978、0.953、0.974、0.947、0.964、0.847、0.816、0.950。
-
2.3 标准曲线和检测限
-
分别取“1.2.1”项下的对照品溶液制备成系列质量混合标准品溶液，在“1.2.3”条件下，以对照品质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，以信噪比为3∶1计算分析方法的检测限（LOD）。结果显示各化合物在一定的质量浓度范围下，峰面积有良好的线性相关性（表2），相关系数大于0.999，LOD为2.2~30.4 ng·mL-1。
-
2.4 加标回收实验
-
称取已知含量的牡荆叶样品，平行精密称定6份，加入一定量的对照品混合储备溶液，于“1.2.3”项下的色谱条件进样分析。表2结果显示，10种化合物的回收率为90.13%~99.56%，RSD≤6.41%，该方法的准确度良好。
-
2.5 含量测定
-
按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，于“1.2.3”项的色谱条件下，测定不同产地牡荆叶的10个化合物含量，结果见表3。由表3可知，牡荆叶含有丰富的酚酸和黄酮类化合物，不同批次和产地的各成分含量存在较大差异。以各批次含量的平均值计算，含量最高的化合物为绿原酸，其次分别为异荭草苷、木犀草苷、异牡荆素、异绿原酸A、异绿原酸C、原儿茶酸、荭草苷、异绿原酸B、新绿原酸。
-
2.6 聚类分析
-
为了研究产地与含量之间的关系，以21个共有峰的相对峰面积为变量，采用HCA分析方法，通过SPSS 26软件采用平方欧式距离为测量度对18批牡荆叶样品进行聚类分析（图3）。图3结果表明，当欧式距离为4左右时，药材可分为3类，即测定的10个化合物总含量分别为13.06~31.69、38.01~41.03、78.99 mg·g-1。河北产地药材为13.06~31.69 mg·g-1，而广东和广西的在分类中存在交叉情况。
-
2.7 总峰面积、总酚含量、总黄酮含量及体外抗氧化实验结果
-
18批牡荆叶HPLC-ECD总峰面积、总酚、总黄酮含量及体外抗氧化实验结果见表4。由表4可知，不同批次牡荆叶的总酚、总黄酮类化合物存在较大差异，其含量分别为15.82~61.83 mg·g-1和27.85~157.65 mg·g-1。牡荆叶具有一定的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、氧自由基吸收能力及铁离子还原能力，说明牡荆叶80%甲醇提取物具有一定抗氧化活性。
-
2.8 谱-效关系分析
-
2.8.1 皮尔逊相关分析
-
对牡荆叶HPLC-ECD样品的总峰面积、总酚含量、总黄酮含量分别与体外抗氧化活性进行皮尔逊相关分析比较，结果见表5。
-
图1 18批牡荆叶指纹图谱
-
Fig.1 Fingerprints of 18 batches of Vitex negundo var. cannabifolia leaves
-
图2 混合标准品图（A）和对照指纹图谱（B）
-
Fig.2 Chromatograms of mixed reference substance (A) and reference fingerprint (B)
-
由表5可知，牡荆叶中总酚、总黄酮含量分别与DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、ORAC氧自由基吸收能力及铁离子还原能力均呈显著正相关，相关系数大于0.77。ECD检测器可选择性地检测具有氧化还原性质的化合物，同时，分析结果表明HPLC-ECD样品中总峰面积与总酚、总黄酮的含量和体外抗氧化活性均呈显著正相关。
-
2.8.2 灰度关联分析
-
采用均值化法对原始数据进行无量化处理。以不同批次牡荆叶的抗氧化结果作为母序列，以共有峰峰面积作为子序列，分辨系数ρ取0.5，按照文献（帖晓燕等，2021; Du et al.，2021）的方法计算共有峰与药效之间灰度关联度系数（r）的大小，结果见表6。
-
由表6可知，牡荆叶中的共有峰与各抗氧化活性的关联度很高，关联度均大于0.79，表明牡荆叶的抗氧化活性是多种化合物的协同作用结果。以4种抗氧化活性关联度的平均值计算，关联度最高的10个峰依次为峰9（异荭草苷）＞峰4＞峰2（新绿原酸）＞峰5（绿原酸）＞峰6＞峰11（异牡荆素）＞峰20＞峰12（木犀草苷）＞峰15（异绿原酸A）＞峰14（异绿原酸B）。
-
2.8.3 PLSR分析
-
PLSR分析是以典型相关分析、主成分分析和多元线性回归分析方法为基础的多元统计方法，能反映共有峰对药效指标的综合贡献程度，相关系数大于0，表明二者之间呈正相关，反之为负相关；在重要投影（VIP）模型中，VIP值＞1，表明该成分对模型有显著影响（刘晓燕等，2020）。本研究以不同批次的牡荆叶HPLC-ECD指纹图谱中各共有峰的峰面积为自变量（X），以不同批次牡荆叶的抗氧化结果为因变量（Y），采用SIMCA 14.1软件进行PLSR分析，计算X对应Y的回归系数和VIP值，结果见图4。
-
注：**表示相关性显著（P ＜ 0.01）。
-
Note:**indicates a significant correlation (P ＜ 0.01) .
-
图3 牡荆叶系统聚类分析
-
Fig.3 HCA of Vitex negundo var. cannabifolia leaves
-
由图4可知，峰1（原儿茶酸）和峰16与抗氧化效果呈负相关，其余共有峰在PLSR模型中与各抗氧化活性的回归系数均呈正相关。共有峰与抗氧活性呈正相关且VIP值大于1的峰有3、4、5（绿原酸）、6、8（荭草苷）、9（异荭草苷）、19、20。
-
3 讨论与结论
-
本研究建立了18批牡荆叶药材的HPLC-ECD指纹图谱，提取出21个共有峰，相似度在0.816以上，说明不同来源的牡荆叶样品质量较为相近。通过参考文献（罗娅君等，2011; Huang et al.，2015）等资料，借助超高效液相色谱串联质谱仪定性和标准品进行比较，共指认出10个峰，并对其进行定量分析，结果表明牡荆叶主要成分为绿原酸、异荭草苷、木犀草苷和异牡荆素等。通过HCA分析可知，牡荆叶药材可能受到采收季节、气候和新老叶等的影响，样品分类存在产地交叉情况，而我们所测定化合物的含量差异可能对样品分类起着相对重要的作用。
-
图4 牡荆叶各共有峰与抗氧化活性的PLSR模型回归系数（A）和VIP值（B）
-
Fig.4 Regression coefficients (A) and VIP values (B) between common peaks and antioxidant activities in Vitex negundo var. cannabifolia leaves analyzed by PLSR model
-
对牡荆叶进行体外抗氧化实验并进行皮尔逊相关分析比较，结果表明牡荆叶具有较强的抗氧化活性，样品中的总峰面积、总酚、总黄酮和体外抗氧化活性相互之间均呈显著相关性，这与前人的研究结果（Hu et al.，2015; Wang et al.，2022）相符，说明总酚、总黄酮可能是牡荆叶抗氧化活性的主要化合物，HPLC-ECD能够检测牡荆叶中的抗氧化活性物质。借助GRA和PLSR分析方法对牡荆叶的共有峰与抗氧化活性进行谱-效关系研究。GRA分析结果表明牡荆叶的抗氧化活性是多种成分协同作用产生的，同时，结合PLSR分析，对牡荆叶抗氧化活性贡献最大的为峰9（异荭草苷），其次为峰4和峰5（绿原酸）。绿原酸已被报道可能是区分牡荆不同药用部位的潜在化学标志物，能作为牡荆质量控制的定量指标之一（Hu et al.，2015），其具有多种功能的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗菌等（王文龙等，2017）。同时，Deepha等（2014）研究表明异荭草苷因含有3′-OH的B环、分子内氢键、O-H等结构，在药物植物中表现出很强的抗氧化活性（Deepha et al.，2015）。因此，现有研究可反向说明该谱-效关系结果的准确性。
-
综上所述，本研究首次基于HPLC-ECD建立牡荆叶药材的指纹图谱，本方法筛选得到的抗氧化活性化合物主要为绿原酸类化合物和黄酮类化合物，化合物含量差异对样品分类有一定的影响，其中异荭草苷和绿原酸对牡荆叶药材抗氧化作用有重要贡献。本方法可为牡荆叶药材关键成分的质量控制及质量标志物筛选提供参考，对牡荆叶药材的质量评价体系的完善具有重要意义。
-
参考文献
-
AATI H, El-GAMAL A, KAYSER O, 2018. Chemical composition and biological activity of the essential oil from the root of Jatropha pelargoniifolia Courb. native to Saudi Arabia [J]. Saudi Pharm J, 27(1): 88-95.
-
Chinese Pharmacopoeia Commission, 2020. Pharmacopoeia of China: Vol. Ⅰ [M]. 2020 ed. Beijing: China Medical Science Press: 1037. [国家药典委员会, 2020. 中国药典: 一部 [M]. 2020版. 北京: 中国医药科技出版社: 1037. ]
-
Compilation of China's Medicinal Herb Writing Group, 1996. Compilation of China's medicinal herb: Vol. 1 [M]. 2nd ed. Beijing: People's Medical Press: 792. [《全国中草药汇编》编写组, 1996. 全国中草药汇编: 上册 [M]. 2版. 北京: 人民卫生出版社: 792. ]
-
DEEPHA V, PRAVEENA R, SADASIVAM K, 2015. DFT studies on antioxidant mechanisms, electronic properties, spectroscopic (FT-IR and UV) and NBO analysis of C-glycosyl flavone, an isoorientin [J]. J Mol Struct, 1082: 131-142.
-
DEEPHA V, PRAVEENA R, SIVAKUMAR R, et al. , 2014. Experimental and theoretical investigations on the antioxidant activity of isoorientin from Crotalaria globos [J]. Spectrochim Acta Part A, 121: 737-745.
-
DU WF, ZHU WH, GE WH, et al. , 2021. Research on the effect of spleen-invigorating and anti-swelling active ingredients in crude and processed Coix seed based on Spectrum-Effects relationship combined with chemometrics [J]. J Pharm Biomed Anal, 205: 114-350.
-
DŻUGAN M, TOMCZYK M, SOWA P, et al. , 2018. Antioxidant activity as biomarker of honey variety [J]. Molecules, 23(8): 2069-2082.
-
HE JM, YIN TP, CHEN Y, et al. , 2015. Phenolic compounds and antioxidant activities of edible flowers of Pyrus pashia [J]. J Funct Foods, 17: 371-379.
-
HUANG MQ, ZHANG YP, XU SY, et al. , 2015. Identification and quantification of phenolic compounds in Vitex negundo L. var. cannabifolia (Siebold et Zucc. ) Hand. -Mazz. using liquid chromatography combined with quadrupole time-of-flight and triple quadrupole mass spectrometers [J]. J Pharm Biomed Anal, 108: 11-20.
-
HU P, LI DH, WANG KB, et al. , 2015. New phenolic compounds from Vitex negundo var. heterophylla and their antioxidant and NO inhibitory activities [J]. J Funct Foods, 19: 174-181.
-
LIU XY, JIANG YP, ZHANG JB, et al. , 2020. Establishment of HPLC fingerprint and its spectrum-effect relationship study of Humulus lupulus [J]. Chin Pharm, 31(2): 138-143. [刘晓燕, 蒋益萍, 张嘉宝, 等, 2020. 啤酒花的HPLC指纹图谱建立及其抗氧化作用谱效关系研究 [J]. 中国药房, 31(2): 138-143. ]
-
LUO M, GU W, HE T, et al. , 2020. Determination of three constituent in Ligustri Lucidi Fructus by ultra-high performance liquid chromatography-electrochemical detection [J]. Chin Pharm J, 55(24): 2006-2011. [罗敏, 顾雯, 何婷, 等, 2020. 超高效液相色谱-电化学检测法测定女贞子中的3种成分 [J]. 中国药学杂志, 55(24): 2006-2011. ]
-
LUO YJ, BIAN QQ, CHEN J, et al. , 2011. Determination of vitexin in Vitex negundo var. cannabifolia by HPLC [J]. Guihaia, 31(3): 418-421. [罗娅君, 边清泉, 陈佳, 等, 2011. HPLC法测定牡荆中牡荆素的含量 [J]. 广西植物, 31(3): 418-421. ]
-
SHU BY, PENG XY, WEI WK, et al. , 2020. Progress on chemical constituents and pharmacological effects of Vitex negundo var. cannabifolia [J]. Progr Veter Med, 41(5): 105-110. [舒柄垚, 彭新宇, 魏文康, 等, 2020. 牡荆的化学成分及药理作用研究进展 [J]. 动物医学进展, 41(5): 105-110. ]
-
TIE XY, DAI HR, XIN GX, et al. , 2021. Spectrum-effect relationship of petroleum ether fraction of Aconitum sinomontanum for promoting qi before and after steaming with licorice juice based on grey correlation analysis [J]. Chin Trad Herb Drugs, 52(5): 1303-1311. [帖晓燕, 戴海蓉, 辛国雄, 等, 2021. 基于灰色关联分析研究甘草汁蒸制前后高乌头石油醚部位行气作用谱效关系 [J]. 中草药, 52(5): 1303-1311. ]
-
WANG JM, YAO C, LI CQ, et al. , 2017. Spectrum-effect relation of antioxidant activity of Flos Carthami based on DPPH, ABTS and FRAP assay [J]. Chin Pharm J, 52(10): 825-831. [王金梅, 姚辰, 李昌勤, 等, 2017. 基于DPPH、ABTS和FRAP法的红花抗氧化谱效关系研究 [J]. 中国药学杂志, 52(10): 825-831. ]
-
WANG Q, XIAO XQ, DONG W, et al. , 2017. Spectrum-effect relationship on expectorant efficacy of Siraitia grosvenorii [J]. Guihaia, 37(5): 606-609. [王勤, 肖喜泉, 董威, 等, 2017. 罗汉果祛痰作用谱效关系研究 [J]. 广西植物, 37(5): 606-609. ]
-
WANG WL, WEN CY, GUO QP, et al. , 2017. Biological properties of chlorogenic acid and its mechanism of action [J]. Chin J Anim Nutr, 29(7): 2220-2227. [王文龙, 文超越, 郭秋平, 等, 2017. 绿原酸的生物活性及其作用机制 [J]. 动物营养学报, 29(7): 2220-2227. ]
-
WANG MY, ZHANG P, ZHANG YZ, et al. , 2022. Chemical fingerprinting, quantification, and antioxidant activity evaluation of Osmanthus fragrans (Thunb. ) Lour. flowers by UPLC-ECD [J]. Int J Food Prop, 25(1): 648-660.
-
XIANG R, SHU BY, GAO Y, et al. , 2021. Chemical constituents and free radical scavenging ability of Vitex tract [J]. Chin J Vet Sci, 41(6): 1146-1153. [向蓉, 舒柄垚, 高原, 等, 2021. 牡荆提取物主要化学成分分析及自由基清除能力 [J]. 中国兽医学报, 41(6): 1146-1153. ]
-
XU WS, LI D, LIU J, et al. , 2014. Study on antioxidant activities of 12 kinds of fruit [J]. Food Ind, 35(1): 247-250. [徐维盛, 李东, 刘静, 等, 2014. ORAC法对12种水果总抗氧化能力评价研究 [J]. 食品工业, 35(1): 247-250. ]
-
YAN CC, ZHANG JF, 2020. Research status of traditional Chinese medicine based on spectrum effect correlation technology [J]. Mod Chin Med, 22(10): 1735-1740. [晏朝操, 张建锋, 2020. 基于谱效关联技术的中药研究现状 [J]. 中国现代中药, 22(10): 1735-1740. ]
-
ZHANG L, TU ZC, WANG H, et al. , 2015. Metabolic profiling of antioxidants constituents in Artemisia selengensis leaves [J]. Food Chem, 186(1): 123-132.
-
ZHANG P, CHUN Z, SHAO Q, et al. , 2021. Evaluation of the phytochemicals and antioxidant activity of Lophatherum gracile brongn based on chemical fingerprinting by HPLC with electrochemical detection [J]. J Sep Sci, 44(20): 3777-3788.
-
摘要
为研究牡荆叶指纹图谱与抗氧化活性的谱-效关系，该研究首先建立了18批牡荆叶的高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ECD）指纹图谱，对不同来源牡荆叶药材进行聚类分析，鉴定主要酚类化合物且测定其含量，分析牡荆叶的总酚和总黄酮含量，并采用DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法、氧自由基吸收能力法及铁离子还原能力法考察其体外抗氧化活性，通过皮尔逊相关分析、灰度关联分析及偏最小二乘回归分析法研究牡荆叶的谱-效关系。结果表明：（1）牡荆叶的指纹图谱标定21个共有峰，共指认出10个峰，其含量顺序为绿原酸＞异荭草苷＞木犀草苷＞异牡荆素＞异绿原酸A＞异绿原酸C＞原儿茶酸＞荭草苷＞异绿原酸B＞新绿原酸；不同产地样品间相似性较高，相似度结果为0.816~0.983。（2）系统聚类分析显示，样品含量对分类有一定影响，不同来源样品被分为3类，其中南北方样品存在一定差异。（3）牡荆叶中总酚和总黄酮的含量分别为15.82~61.83 mg·g-1和27.85~157.65 mg·g-1，样品均具不同程度的抗氧化活性。（4）谱-效关系表明，牡荆叶的抗氧化活性是多种化合物协同作用的结果，峰9（异荭草苷）、峰4和峰5（绿原酸）等化合物对牡荆叶药材抗氧化活性的贡献最大。综上表明，牡荆叶具有较好的抗氧化活性，其中主要的活性指标是异荭草苷和绿原酸。该研究结果可为牡荆叶抗氧化活性成分的筛选及其质量控制提供参考依据。
Abstract
In order to study the spectrum-effect relationship between fingerprint and antioxidant activity of the leaves of Vitex negundo var. cannabifolia, the fingerprints of 18 batches of V. negundo var. cannabifolia leaves were established by high performance liquid chromatography-electrochemical detection (HPLC-ECD), and the cluster analysis of medicinal materials from different sources was performed simultaneously. The main phenolic compounds from V. negundo var. cannabifolia leaves were identified and determined. The contents of total phenolics and total flavonoids in V. negundo var. cannabifolia leaves were analyzed, and the antioxidant activities in vitro were evaluated by the methods of DPPH radical scavenging capacity, ABTS radical scavenging capacity, oxygen radical absorbance capacity and ferric ion reducing ability power. The spectrum-effect relationships of V. negundo var. cannabifolia leaves were analyzed by Pearson correlation analysis, gray relational analysis and partial least square regression analysis. The results were as follows: (1) The fingerprints of V. negundo var. cannabifolia leaves were established with 21 common peaks and a total of 10 peaks were identified. The order of content was chlorogenic acid ＞ isoorientin ＞ luteoloside ＞ isovitexin ＞ isochlorogenic acid A ＞ isochlorogenic acid C ＞ protocatechuic acid ＞ orientin ＞ isochlorogenic acid B ＞ neochlorogenic acid. The similarity among the samples from different producing areas was high, and the values were ranged from 0.816 to 0.983. (2) The results of the cluster analysis showed that the content of the compounds had a certain influence on the classification and the samples from different sources were divided into three categories, among which the samples from the south and the north were different. (3) The contents of total phenolics and total flavonoids in V. negundo var. cannabifolia leaves were 15.82 to 61.83 mg·g-1 and 27.85 to 157.65 mg·g-1, respectively, and the antioxidant activity of all samples from V. negundo var. cannabifolia leaves existed differences. (4) The spectrum-effect relationship indicated that the antioxidant activity of V. negundo var. cannabifolia leaves was the result of the synergistic effect of many compounds, and compounds such as peak 9 (isoorientin), peak 4 and peak 5 (chlorogenic acid) made the greatest contribution to the antioxidant activity of V. negundo var. cannabifolia leaves. V. negundo var. cannabifolia has good antioxidant activity, and the main activity indexes are isoorientin and chlorogenic acid. This study can provide a reference basis for the screening and quality control of antioxidant components in V. negundo var. cannabifolia.
