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巨大侧耳（Pleurotus giganteus），是国内开发的一种珍稀食用菌，其口感和风味独特，有猪肚般的滑腻，因而具有商品名“猪肚菇”（董洪新等，2010；Karunarathna et al.，2012）。巨大侧耳营养丰富，富含多糖、蛋白质、粗纤维等营养物质，并且具有抗炎、抗肿瘤、抗真菌、保护肝脏等多种药用功效，深受消费者喜爱（Phan et al.，2014；Paravamsivam et al.，2016）。于海龙等（2021） 研究发现，巨大侧耳环境适应性强、生物学转化率高，并且适宜在温度较高的夏季栽培，对调节食用菌市场供应和反季节栽培，特别是热区食用菌生产具有重要意义。随着栽培面积的不断扩大，巨大侧耳的遗传育种工作尤为重要（吴碧君，2020）。原生质体是指完整细胞去除细胞壁后，裸露出的一个具有生理功能的圆球体，仍含有整套的遗传信息，并且具有较好的生理活性，是食用菌分子遗传学研究的良好材料（Muralidhar &Panda，2000））。近年来，原生质体单核化技术，已成功应用到食用菌生理生化、菌种复壮、遗传转化、遗传育种和全基因组测序等工作中（Dai et al.，2017；Sugano et al.，2017；Raman et al.，2021；刘海娟，2021），极大地推进了食用菌研究的深入开展。因此，对巨大侧耳原生质体制备进行系统研究，有助于进一步推进巨大侧耳遗传育种工作的开展。
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目前，关于原生质体的制备在糙皮侧耳（Peng et al.，1993）、刺芹侧耳（Obatake et al.，2003）、黄白侧耳（Mizoguchi et al.，2006）、灵芝（李钦艳等，2016）、木耳（崔玮洁等，2019）和双孢蘑菇（李良敏等，2020）等多个食用菌物种中得到广泛研究。崔玮洁等（2019）研究发现，原生质体的制备属于一种酶促反应过程，其影响因素十分复杂，不同菌株甚至同一菌株不同生理状态下，其原生质体制备条件也不尽相同。苏文英等（2020）发现菌龄是原生质体制备的重要因素，玉木耳菌株在不同菌龄下，其原生质体制备条件存在较大差异。彭智华等（2000）基于单一变量原则，对1株野生巨大侧耳菌株的原生质体分离条件进行研究，发现原生质体产量会受到酶解液、稳渗剂、菌龄和pH的影响，并筛选到适宜的原生质体制备条件，但其制备率和再生率仍不高。邹彰毅和邓百万（2020）、孙佳星等（2022）基于正交试验和响应面法，进一步优化了单因素结果，分别获得了姬松茸和玉木耳原生质体制备的最优条件，极大地提高了原生质体产量和质量。可见，原生质体的制备受到多种因素的影响，且各因素间的交互作用也十分重要。然而，关于巨大侧耳原生质体制备的研究较少，各因素对原生质体产量的影响程度及各因素间的交互作用也尚不明确，在一定程度上限制了巨大侧耳遗传育种工作的快速发展。
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因此，本研究以前期筛选到的两株不同温型的巨大侧耳菌株为材料，采用单因素和正交试验的方法，对巨大侧耳原生质体制备中的菌丝体菌龄、溶壁酶浓度、稳渗剂种类、酶解温度和时间共5个关键影响因子进行研究。以期明确两株不同温型巨大侧耳菌株的原生质体制备条件及差异，针对性提高巨大侧耳原生质体制备效率。本研究结果可为进一步开展巨大侧耳的杂交育种、全基因组测序和品种改良等奠定良好基础，进而有效推动巨大侧耳遗传育种工作的深入开展。
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1 材料与方法
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1.1 材料
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两株不同温型的巨大侧耳菌株，分别为高温型菌株PG46和中温型菌株PG79（表1）。菌种现保存于中国热带农业科学院环境与植物保护研究所菌种保藏中心。
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MYG液体培养基：麦芽糖10 g，葡萄糖5 g，酵母浸粉5 g，加水混匀后，定容至1 L。
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再生培养基：麦芽糖10 g，葡萄糖5 g，酵母浸粉5 g，琼脂20 g，0.6 mol·L-1甘露醇，加水混匀后，定容至1 L。
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1.2 方法
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1.2.1 原生质体制备
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将活化好的菌丝体接入MYG液体培养基中，于转速150 r·min-1、26℃恒温暗培养7 d。无菌条件下，过滤菌丝体，并先后用无菌水和稳渗剂（0.6 mol·L-1的甘露醇）各冲洗2次。将菌丝体置于滤纸上吸干，并称取300 mg左右放入1.5 mL离心管中，加入3倍体积的2.0%浓度的溶壁酶溶液（0.02 g溶壁酶，1 mL的0.6 mol·L-1甘露醇）。轻搅混匀后放入30℃的恒温金属浴中，酶解4 h得到原生质体粗提液。用无菌脱脂棉过滤后，3 000 r·min-1离心5 min，倒掉上清液。用0.6 mol·L-1的甘露醇轻轻冲洗管壁2次，去除多余酶解液，加入1 mL的0.6 mol·L-1甘露醇以悬浮沉淀，制成原生质体原液。
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1.2.2 原生质体再生
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用0.6 mol·L-1的稳渗剂，将原生质体原液稀释不同倍数，并在血球计数板下计数。分别吸取200 μL各稀释倍数的原生质体溶液，均匀涂布到再生培养基上，无菌水稀释的原生质体作对照。将实验组和对照组均置于26℃恒温暗培养，每天观察菌落再生情况。
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1.2.3 单因素实验
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分别设置菌龄（3、5、7、9、11 d）、溶壁酶浓度（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、稳渗剂种类（甘露醇、山梨醇、蔗糖、硫酸镁、氯化钾）、酶解温度（25、27、30、32、35、38℃）和酶解时间（2、3、4、5、6 h）共5个处理因素（崔玮洁等，2019；苏文英等，2020），每个实验设置5次重复，统计各因素对不同温型巨大侧耳菌株原生质体产量的影响。
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1.2.4 正交试验
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在单因素实验基础上，分别选取菌龄、溶壁酶浓度、酶解温度和酶解时间为考察因素，以原生质体产量为响应值，组成4因素3水平的正交试验（表2），以确定巨大侧耳原生质体制备的最适条件。
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2 结果与分析
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2.1 原生质体的释放
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将两菌株的菌丝体置于溶壁酶溶液中，在适宜温度下进行酶解。每隔半小时取一次样，置于血球计数板中，在显微镜下观察原生质体的释放情况。结果显示，巨大侧耳的原生质体释放分为3个阶段（图1）：前期，少量原生质体从菌丝体尖端释放；中期，部分菌丝体侧壁破裂，原生质体从菌丝体侧面释放；后期，随着酶解时间的延长，多数菌丝体细胞壁破裂，大量原生质体释放出来。
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图1 显微镜下原生质体释放的部分图片
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Fig.1 Some pictures of protoplast release under microscope
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2.2 单因素实验结果
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2.2.1 菌丝体菌龄对原生质体制备的影响
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由图2：A可知，巨大侧耳的原生质体产量，随着菌龄的增加，呈现先上升后下降的趋势。在5 d时，PG46和PG79的原生质体产量均达到最高，分别为4.82×106 CFU·mL-1和2.74×106 CFU·mL-1，且与其他菌龄的产量差异显著；菌龄超过5 d后，原生质体产量下降，特别是11 d时原生质体产量最低，且低于最开始3 d的产量，分别为0.62×106 CFU·mL-1和0.86×106 CFU·mL-1。综上可知，两菌株制备原生质体的菌丝体最适菌龄为5 d。
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2.2.2 稳渗剂种类对原生质体制备的影响
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由图2：B可知，不同稳渗剂中，PG46的原生质体产量由高到低依次为甘露醇＞山梨醇＞蔗糖＞硫酸镁＞氯化钾，最高产量为2.74×106 CFU·mL-1，其中甘露醇、山梨醇和蔗糖三者中的原生质体产量无显著差异，但均显著高于硫酸镁和氯化钾；PG79的原生质体产量由高到低依次为蔗糖＞甘露醇＞山梨醇＞氯化钾＞硫酸镁，最高产量为1.88×106 CFU·mL-1，前三者产量无显著差异，但均显著高于硫酸镁和氯化钾。可见，稳渗剂类别对PG46和PG79的原生质体产量影响显著，有机糖醇类稳渗剂甘露醇、山梨醇和蔗糖均为制备巨大侧耳原生质体的适宜稳渗剂。
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2.2.3 溶壁酶浓度对原生质体制备的影响
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由图2：C可知，随着溶壁酶浓度的增加，PG46和PG79的原生质体产量先增加后降低。当溶壁酶浓度为2.5%时，两菌株的原生质体产量均达到最高，分别为7.64×106 CFU·mL-1和7.38×106 CFU·mL-1；当浓度为3.0%时，原生质体产量下降且与2.5%浓度的原生质体产量具有显著差异。可见，制备巨大侧耳原生质体的最适溶壁酶浓度为2.5%。
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2.2.4 酶解温度对原生质体制备的影响
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由图2：D可知，随着酶解温度的升高，PG46和PG79的原生质体产量呈现先增加后降低的趋势。当酶解温度为32℃时，PG46的原生质体产量达到最高，为6.22×106 CFU·mL-1，且与其他酶解温度差异显著；PG79的原生质体产量也在32℃时达到最高，为3.54 ×106 CFU·mL-1，但与27、30、35℃的原生质体产量无显著差异。综上可见，PG46原生质体制备的最适酶解温度为32℃，PG79原生质体制备的适宜酶解温度较广，为27~35℃。
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2.2.5 酶解时间对原生质体制备的影响
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由图2：E可知，PG46和PG79的原生质体产量，随酶解时间的增加呈先上升后下降的趋势。当酶解时间为4 h时，两菌株的原生质体产量均达到最高，分别为9.12×106 CFU·mL-1和6.48×106 CFU·mL-1，但均与酶解时间5 h无显著差异；当酶解时间大于5 h时，原生质体产量显著下降。因此，4~5 h为制备巨大侧耳原生质体的适宜酶解时间。
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图2 不同因素对两株巨大侧耳菌株原生质体产量的影响
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Fig.2 Effects of various factors on protoplast yield of two Pleurotus giganteus strains
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2.3 正交试验交互作用分析结果
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为探究不同因素对原生质体制备的交互影响，采用正交试验的方法，进一步探究制备巨大侧耳原生质体的最适条件。由表3可知，9种正交组合均可用于PG46的原生质体制备和再生。其中，原生质体得率最高的为组合2（菌龄5 d，溶壁酶浓度2.5%，0.6 mol·L-1的甘露醇，32℃酶解4 h），原生质体产量高达11.22×106 CFU·mL-1，显著高于其他组合。原生质体再生率最高的为组合1（菌龄5 d，溶壁酶浓度2.0%，0.6 mol·L-1的甘露醇，30℃酶解3 h），再生率达1.20%。可见，PG46原生质体再生与原生质体制备的最适条件存在一定差异。由表3和表4可知，4个主要因素对PG46原生质体制备的影响程度大小依次为菌龄＞溶壁酶浓度＞酶解温度＞酶解时间，且各因素影响差异极显著（P＜0.001）。
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由表5可知，9种正交组合均可用于PG79的原生质体制备，但部分组合不适宜其原生质体再生。其中，PG79原生质体得率最高的为组合3（菌龄5 d，溶壁酶浓度3.0%，0.6 mol·L-1的甘露醇，35℃酶解5 h），原生质体产量高达7.28×106 CFU·mL-1，但与组合1和组合2的原生质体得率无显著差异。原生质体再生率最高的为组合1（菌龄5 d，溶壁酶浓度2.0%，0.6 mol·L-1的甘露醇，30℃酶解3 h），再生率为0.45%。但是，在原生质体最适制备条件下，原生质体再生率为0。由表5和表6可知，各因素对PG79原生质体制备的影响程度依次为菌龄＞酶解时间＞酶解温度＞溶壁酶浓度，且各因素影响差异显著（P＜0.05）。
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注：大写字母A、B、C、D分别表示菌龄、溶壁酶浓度、酶解温度和酶解时间4个因素。数字1、2、3分别表示对应因素的3个水平。小写字母a、b、c、d表示原生质体产量有显著差异（P＜0.05）。下同。
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Note: The capital letters A, B, C and D indicate four factors, mycelial age, lywallzyme concentration, enzymatic hydrolysis temperature and enzymatic hydrolysis duration, respectively. The numbers 1, 2 and 3 indicate the three levels of corresponding factors, respectively. The lowercase letters a, b, c, d indicate significant differences for protoplast yield (P＜0.05) . The same below.
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3 讨论与结论
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本研究采用单因素实验和正交试验的方法，对2株不同温型的巨大侧耳菌株原生质体制备的关键因素（菌丝体菌龄、稳渗剂种类、溶壁酶浓度、酶解温度和酶解时间）进行优化，以期明确巨大侧耳原生质体制备的适宜条件。结果表明，组合2是PG46的最适组合，组合1、2、3是PG79的适宜条件组合，而组合3条件下再生率为0，因此PG79的最适条件是组合1和组合2。因此，组合2可同时作为PG46和PG79的适宜条件。同时也说明，各影响因素间存在一定的交互作用，在进行条件优化时不可忽略。F-test分析显示，菌丝体菌龄对两株巨大侧耳菌株的原生质体产量影响均为极显著，但溶壁酶浓度、酶解温度和酶解时间对两菌株的影响程度存在差异。推测是由于巨大侧耳的遗传多样性丰富，PG46和PG79菌株间产生了遗传分化（Dai et al.，2019）。
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菌株的生理状态和不同的酶解条件，对食用菌原生质体产量和质量均具有不同程度的影响（孙佳星等，2022）。在本研究中，菌丝体的菌龄，是影响巨大侧耳原生质体制备的最主要因素。不同时期的菌丝体，细胞壁厚度和生长活力不同，对溶壁酶的敏感性也存在差异（张文学等，2003）。在菌丝生长前期，细胞壁较薄，更易被溶壁酶降解，随着菌龄的继续增加，细胞壁逐渐加厚且产生的次生物质增多，酶解效率降低，进而导致原生质体产量下降（Kim et al.，2000）。本研究前期对巨大侧耳菌丝体培养时，发现第5天正是巨大侧耳菌丝体生长的指数生长期，此时细胞壁厚度和菌丝体活力均适宜，可作为原生质体制备的理想时期和材料。
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由于原生质体失去了细胞壁，对外界环境十分敏感，稳渗剂可保持原生质体内外的压力平衡，避免其破裂或皱缩（Pasternak et al.，2002）。同时，稳渗剂在细胞与溶壁酶的反应中起媒介作用，其性质影响溶壁酶的反应活性，因此稳渗剂的选择非常重要（刘玉霞等，2009）。本研究中，以甘露醇、山梨醇和蔗糖为稳渗剂时原生质体产量均较高，且显著高于硫酸镁和氯化钾。前人研究也发现，有机糖醇稳渗剂和无机盐稳渗剂在食用菌原生质体制备中影响差异很大（邹彰毅等，2020；孙佳星等，2022）。产生这一结果可能是因为有机糖醇不仅能维持渗透压平衡，还能促进酶与底物的结合，进而提高了酶促反应的产量（谭文辉等，2006）。
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溶壁酶是裂解细胞壁，获得原生质体的关键，酶的类型和浓度可以影响原生质体的活力和数量（Kanchanapoom &Jantaro，2001）。李光环（2018）研究发现，单一的溶壁酶适合多种食用菌的原生质体制备，在保证较高效率的同时成本也较低。但由于不同真菌的细胞壁组成和结构不同，不同浓度的溶壁酶的酶解效果也会有所差异。本研究结果表明，在一定范围内，溶壁酶浓度越高，原生质体产量越高，但浓度超过2.5%后，原生质体产量开始下降。这可能是因为酶浓度过高会对原生质体的膜造成影响，使得细胞脱壁太彻底，后期也会影响原生质体的再生（孙剑秋和周东波，2002）。
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在相同的溶壁酶浓度下，酶解温度和酶解时间是影响破壁效果的关键。根据酶反应的动力学原理，酶解温度直接影响酶促反应的速度，还会影响细胞壁的生理状态，适宜的酶解温度有助于溶壁酶发挥最佳的裂解作用。本研究中，32℃为两菌株的最适酶解温度，低于该温度时需适当延长酶解时间来获得较高的原生质体产量，高于该温度时原生质体产量下降且再生率也降低。一方面，可能是因为温度过低时，酶活力不足，且菌丝生理代谢慢，导致酶解反应较慢；温度过高，会破坏酶的稳定性，降低溶壁酶活性和损伤已游离的原生质体，进一步影响细胞再生率（张丽霞和郭成金，2008；贺婷和郭成金，2012）。另一方面，酶解时间可以影响酶促反应的程度，适当延长酶解时间可获得较高的原生质体释放量。本研究中，两菌株的最适酶解时间均为4 h，超过4 h原生质体产量开始下降。推测是因为失去细胞壁的原生质体稳定性下降，由于酶的作用及渗透作用，酶解时间过长会导致原生质体破裂。并且原生质体再生时需要一定量的细胞壁酶解残余物，酶解时间过长会导致酶解残余物过少甚至消失（郭成金和赵润，2009）。王昱等（2013）研究也发现，酶解时间过长，较早释放出的原生质体无细胞壁保护而破裂，其活性下降难于再生。因此，适宜的酶解时间尤为重要。
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综上所述，两株不同温型巨大侧耳菌株的原生质体制备的最适条件相同，但各因素对两菌株原生质体产量的影响不同。因此，在制备巨大侧耳不同菌株的原生质体时，应按照各菌株情况和实验需求进行适当调整。本研究结果可为后续的巨大侧耳杂交育种、遗传转化、全基因组测序等工作奠定基础，有利于推动巨大侧耳产业的发展。
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摘要
为优化巨大侧耳原生质体的制备条件，该研究以两株不同温型的巨大侧耳菌株PG46和PG79为材料，采用单因素和正交试验方法对原生质体制备的菌丝体菌龄、稳渗剂种类、溶壁酶浓度、酶解温度和酶解时间进行研究。结果表明：（1）在单因素实验中，巨大侧耳原生质体制备的适宜条件为菌龄5 d，溶壁酶浓度2.5%，0.6 mol·L-1甘露醇，32 ℃（PG46）或27~35 ℃（PG79）酶解4 h。（2）正交试验验证并优化了单因素实验结果，组合2（菌龄5 d，溶壁酶浓度2.5%，0.6 mol·L-1的甘露醇，32 ℃酶解4 h）可同时作为PG46和PG79原生质体制备的最适条件，原生质体产量分别为11.22×106 CFU·mL-1和7.28×106 CFU·mL-1。（3）F-test检验中，各因素对原生质体制备的影响程度依次为菌龄＞溶壁酶浓度＞酶解温度＞酶解时间（PG46），菌龄＞酶解时间＞酶解温度＞溶壁酶浓度（PG79）。综上所述，两株不同温型巨大侧耳菌株的原生质体制备条件基本一致，菌龄对两菌株原生质体得率的影响程度最显著。该研究结果可为后续巨大侧耳的杂交育种、遗传转化、全基因组测序等工作奠定基础，进一步推动巨大侧耳分子遗传学的发展。
Abstract
In order to obtain the optimal conditions for the protoplast preparation of Pleurotus giganteus, two strains, PG46 and PG79, with different temperature types, were selected as materials to study the effects of five factors (mycelial age, osmotic stabilizer type, lywallzyme concentration, enzymatic hydrolysis duration and enzymatic hydrolysis temperature) based on single factor and orthogonal experimental methods. The results were as follows: (1) In the single factor test, the optimal conditions for the protoplast preparation of P. giganteus were mycelial culture for 5 d, using 2.5% lywallzyme with 0.6 mol·L-1 mannitol, incubated for 4 h at 32 ℃ (PG46) or 27-35 ℃ (PG79). (2) Orthogonal experiment verified and optimized the single factor test results. Combination 2 (mycelial age 5 d, lywallzyme concentration 2.5%, 0.6 mol·L-1 mannitol, incubated for 4 h at 32 ℃) could be used as the optimal condition for the protoplast preparation of PG46 and PG79 at the same time, and the protoplast yields were 11.22 × 106 CFU·mL-1 and 7.28 × 106 CFU·mL-1, respectively. (3) For F-test, the influence degree of various factor on the protoplast preparation were mycelial age＞lywallzyme concentration＞enzymatic hydrolysis temperature＞enzymatic hydrolysis duration (PG46), and mycelial age＞enzymatic hydrolysis duration＞enzymatic hydrolysis temperature＞lywallzyme concentration (PG79), respectively. In conclusion, the protoplast preparation conditions of the two P. giganteus strains with different temperature types were basically the same, and the effects of mycelial age on the protoplasts yield of the two strains were the most significant. The results can lay a foundation for further cross-breeding, genetic transformation, whole genome sequencing and promote the molecular genetics development of P. giganteus.