海三棱藨草 [× Bolboschoenoplectus mariqueter（Tang &F. T. Wang）Tatanov]属于莎草科（Cyperaceae），主要分布在长江河口及杭州湾滩涂，曾被报道为我国特有的滩涂湿地先锋种（唐进和王发瓒，1965），具有维持生物多样性、消减波浪、固滩护堤、促进泥沙沉降和为迁徙越冬的水鸟提供栖息地等多种生态功能（朱晶等，2007；陈秀芝和孙瑛，2011）。

海三棱藨草的正名问题及其所在属的分类地位一直未能得到解决。海三棱藨草因其秆为三棱形，花序假侧生等性状与藨草（Scirpus triqueter L.）相似，而其穗大和小坚果表面网纹等性状又与扁秆藨草（S. planiculmis Fr. Schmidt）相似，被以藨草和扁秆藨草的天然杂交种（Scirpus × mariqueter Tang et F. T. Wang）发表（唐进和王发瓒，1965）；随着藨草属（Scirpus L.）系统学研究的不断深入，广义藨草属被划分为若干属，海三棱藨草的亲本藨草和扁秆藨草被划分到不同的属，即水葱属 [Schoenoplectus（Rchb.）Palla]和三棱草属 [Bolboschoenus（Asch.）Palla]，二者的中文名和学名变更为三棱水葱 [Schoenoplectus triqueter（L.）Palla]和扁秆荆三棱 [Bolboschoenus planiculmis（F. Schmidt）T. V. Egorova]；Tatanov（2007）承认海三棱藨草为属间杂交种，并以此建立了新的杂交属 × Bolboschoenoplectus Tatanov，因此海三棱藨草的学名变更为 [× Bolboschoenoplectus mariqueter（Tang &F. T. Wang）Tatanov]（Dai et al.，2010）。Koyama（1980）将 Scirpus × mariqueter作为 Bolboschoenus planiculmis的异名，认为海三棱藨草只是扁秆荆三棱的单穗变异类型。随着测序技术的不断发展，一些分子标记被开发应用于海三棱藨草及其近缘种的遗传结构和亲缘关系分析中。Yang 等（2009，2013）通过AFLP分子标记技术和种间杂交试验分析了海三棱藨草与其潜在亲本扁秆荆三棱和三棱水葱的亲缘关系，结果表明海三棱藨草非杂交起源且与扁秆荆三棱的亲缘关系更近，但作者未明确界定二者是否为独立的物种。另外，前人还采用AFLP分子标记技术和微卫星标记技术揭示了扁秆荆三棱和海滨三棱草 [Bolboschoenus maritimus（Linnaeus）Palla]遗传结构的相似性，并在二者分布的重叠区域发现了大量的杂交后代，但这些个体无法通过分类函数进行明确的物种界定（Zhou et al.，2009; Píšová et al.，2017）。有研究表明，三棱草属植物果实的横切面形状和果皮厚度是重要的种间鉴别特征（Hroudová et al.，2007; Píšová et al.，2017）。宋晨薇等（2019）通过观察比较海三棱藨草及其近缘种的果实形态和果皮微结构特征，发现海三棱藨草在果实形态和果皮厚度上与扁秆荆三棱明显差异而与海滨三棱草相似，因而推论其为海滨三棱草水滨亚种 [Bolboschoenus maritimus subsp. paludosus（A. Nelson）T. Koyama]的异名。综上认为，海三棱藨草的分类地位及其与近缘种的亲缘关系仍然需要进一步探究。

2003年，Hebert首次提出了DNA条形码技术，即利用一段公认的、标准的、易于扩增的且具有足够变异的短DNA片段来实现对物种的快速鉴定（Hebert et al.，2003a，b）。经过20年的发展，DNA条形码技术已经成为生命科学研究中发展最迅速的方向之一，在植物物种鉴定及分子系统学研究领域彰显出广阔的应用前景（Costion et al.，2011; Li et al.，2015; Hu et al.，2022）。目前，DNA条形码技术已被广泛应用于莎草科植物的鉴定、系统发育关系和演化历史的研究中，并且取得了一定的成果（Yen &Olmstead，2000; Starr et al.，2009; Clerc-Blain et al.，2010; Glon et al.，2017; Léveillé-Bourret et al.，2020）。但关于海三棱藨草及其近缘种基于基因片段的分子系统学研究相对滞后。准确的物种鉴定是生物多样性保护的基础和前提（Vane-Wright et al.，1991）。实现海三棱藨草的科学鉴定对三棱草属植物系统发育重建及分类学研究具有重大的理论意义和实际价值。

本研究通过选用6组候选序列（ITS、matK、ndhF、rbcL、trnL和trnL-trnF）对海三棱藨草及其3个近缘种共21个样本进行DNA条形码研究，通过比较分析扩增序列的特征、种内种间变异率和鉴定效率等指标，评估不同候选序列及其组合的物种分辨能力，拟筛选出适用于海三棱藨草及其近缘种鉴定的最佳DNA条形码序列，同时基于建树法进行系统发育分析，进一步探讨海三棱藨草与其近缘种之间的关系，以期为海三棱藨草的分类学研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究选取海三棱藨草 [× Bolboschoenoplectus mariqueter（Tang &F.T.Wang）Tatanov]及其3个近缘种，包括扁秆荆三棱 [Bolboschoenus planiculmis（F. Schmidt）T. V. Egorova]、海滨三棱草 [B. maritimus（Linnaeus）Palla]和荆三棱 [B. yagara（Ohwi）Y. C. Yang &M. Zhan]总共21份样本作为研究材料（表1），本研究中海三棱藨草及其近缘种的形态特征及地理分布比较详见表2和表3。

1.2 方法

1.2.1 植物基因组的提取、PCR扩增及测序

采用植物基因组DNA试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取植物的总DNA。序列扩增用到的引物信息及PCR反应的扩增程序见表4。PCR扩增采用100 mL反应体系：灭菌后的ddH₂O 69.5 mL，TaqBuffer 10 mL，dNTP 8 mL，上、下游引物各4 mL，DNA模板4 mL，EX Taq酶0.5 mL；扩增完成后用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，筛选出条带清晰的样品送到北京六合华大基因科技有限公司进行双向测序。

1.2.2 数据处理

利用DNASTAR Lasergene软件包 （DNASTAR Inc.，Madison，WI，USA）中的SeqMan 软件对测序得到的双向峰图进行校对、拼接，去除两端峰图杂乱、质量较低的序列，采用MEGE 7.0软件进行多序列比对，利用DnaSP 6.0 统计各个DNA条形码序列的特征信息和变异位点信息；基于K2P （Kimura2-parameter model）双参数模型计算种内和种间的遗传距离，评价条形码在种内、种间的变异情况；利用相似性搜索算法（basic local alignment search tool，BLAST）考察分析各条形码候选序列的鉴定效率，通过将实验获得的全部序列作为查询序列输入到GenBank数据库中，利用NCBI-BLAST相似性比对工具进行批量数据分析。当返回的比对结果中最大的相似物种（identity ＞ 95%且E值 ＜ 1×10^-5）与该查询序列所属的物种一致且不包含其他物种时则视该物种鉴定成功，反之则视为鉴定失败。对于联合片段物种鉴定效率的计算，在本研究中只要其中一个片段能够成功鉴定出该物种，则组合片段也能鉴定出该物种（Liu et al.，2015），物种鉴定效率=鉴定成功物种个体数/总个体数。采用贝叶斯推断法构建系统发育树，进行遗传聚类分析。

2 结果与分析

2.1 DNA条形码候选片段的序列特征分析

对海三棱藨草及其近缘种的6组DNA条形码候选序列进行统计分析，结果（表5）表明，在各条形码中，rbcL序列最长，为1 374 bp，trnL-trnF序列最短，为444 bp；ITS序列的GC含量最高，而trnL序列的GC含量最低。6个DNA条形码片段的变异位点数依次排序为ITS ＞ ndhF ＞ matK ＞ rbcL ＞ trnL ＞ trnL-trnF。海三棱藨草及其近缘种的核基因ITS序列变异位点数远大于其他5个叶绿体基因片段的变异位点数。

2.2 DNA条形码候选片段的种内、种间遗传变异

理想的DNA条形码序列种内变异水平应明显小于种间变异水平（宁淑萍等，2008）。本研究的种内和种间K2P遗传距离结果（表6）显示，6组DNA条形码候选序列的种内变异水平均为0，除ITS序列之外，其余5组DNA条形码候选序列的种内和种间变异均存在不同程度的重叠，各个条形码种间的变异大小依次排序为ITS ＞ ndhF ＞ matK ＞ trnL ＞ rbcL ＞ trnL-trnF。

2.3 DNA条形码候选片段的鉴定效率评价

本研究采用BLAST法分析6组DNA条形码候选序列的鉴定效率，结果（表7）显示，单一序列的鉴定效率均未达到100%，matK 鉴定效率最高为52.4%，其次是ndhF和rbcL均为28.6%，ITS的鉴定效率为23.8%，trnL-trnF 和trnL 片段的物种鉴定效率为0。在组合条形码中，ITS + matK 的鉴定效率最高为71.4%，其次是matK + ndhF 和matK + rbcL的鉴定效率均为61.9%，而ITS + ndhF、ITS + rbcL、ITS +（ trnL-trnF）和ITS + trnL组合的鉴定效率分别为52.4%、52.4%、23.8%和23.8%。

2.4 遗传聚类分析

为探究海三棱藨草及其近缘种间的关系，本研究基于ITS + matK 序列构建了海三棱藨草及其近缘种的系统发育树，表8列举了从GenBank 数据库中下载的外类群的ITS和matK序列信息。为了评价核基因和叶绿体基因序列联合数据之间的一致性，本研究在PAUP^*4.0b10上进行了不一致长度差异检验（incongruence length difference test，ILD test）（Dolphin et al.，2000）。P值是用来衡量两组数据之间是否存在显著性差异（P＜ 0.05）。计算得出P值为1.0，表明核基因ITS和叶绿体基因matK序列数据之间没有显著性差异，可以联合进行分析。本研究通过采用贝叶斯推断法（Bayesian inference，BI）来进行多基因联合构树，该方法更灵活，考虑更加全面，构树结果更可靠（Heled &Drummond，2009）。ITS和matK 序列联合矩阵总长度为1 839 bp，变异位点数为39。系统发育树结果（图1）表明，各分支聚集良好，大多表现为单系。外类群两个属的物种位于系统树基部，水葱属 [Schoenoplectus（Rchb.）Palla]物种类群自成一支，与三棱草属物种类群 [Bolboschoenus（Asch.）Palla]明显分开，后验概率为1。三棱草属物种类群由海三棱藨草及其近缘种组成，可以分为三个主支。最大一支包括了所有海三棱藨草（× Bolboschoenoplectus mariqueter）和海滨三棱草（Bolboschoenus maritimus）的样本。第二支包括了扁秆荆三棱（B. planiculmis）的6个样本，第三支则由荆三棱 （B. yagara）的所有个体组成，均获得较高支持率。在ITS + matK序列构建的系统发育树中，海三棱藨草与海滨三棱草聚在一起，和扁秆荆三棱的所有样品聚成的一支构成姐妹支，另外，海滨三棱草的一个个体与海三棱藨草聚为一支，但自展值很低；荆三棱自成一支，与海三棱藨草的关系最远。

3 讨论与结论

由于植物的进化历史复杂，目前尚未发现和动物COI基因一样，能够用作植物通用条形码的单一片段，因此从植物叶绿体基因组和核基因组中筛选出高效且通用的DNA条形码候选片段一直是困扰植物学家的重要难题（李德铢和曾春霞，2015）。本研究应用1个核基因片段（ITS）与5个叶绿体基因片段（matK、ndhF、rbcL、trnL和trnL-trnF）对海三棱藨草及其3个近缘种进行DNA条形码研究，评估6组候选DNA条形码序列及其组合片段的物种鉴定能力，同时探讨海三棱藨草与3个近缘种间的关系。

3.1 不同DNA条形码序列在海三棱藨草及其近缘种中的鉴定效率

被子植物的ITS序列具有侧翼高度保守、拷贝数多、协同进化快、易于扩增、测序和比对等特点（Baldwin et al.，1995），被广泛应用于莎草科植物的系统发育研究中（Yano &Hoshino，2005; Shiels et al.，2014）。本研究用通用引物ITS4/ITS5扩增得到的ITS序列包含了ITS1序列、5.8S rDNA和ITS2序列3个部分，长度为706 bp。Jung和Choi（2010）研究表明，该序列在水葱属和萤蔺属（Schoenoplectiella Lye）植物中的扩增长度为636 bp（Shiels et al.，2014），在藨草属植物中的扩增长度为712 bp，另外该序列在藨草属植物中的变异率高达47.3%，在水葱属和萤蔺属植物中的变异率为32.4%，而在海三棱藨草及其近缘种中的变异率仅为4.96%，推测可能是由研究样本大小差异所导致的。同时，这表明了ITS序列在莎草科不同属中的序列长度和变异水平均有所差异。

matK基因是叶绿体基因组的蛋白编码区中进化速率最快的基因之一（Chase et al.，2007），但其引物通用性还存在较多争议，不同分类群体之间往往需要更换多对引物进行扩增（Fazekas et al.，2008）。本研究共采用两组通用引物进行PCR扩增，得到的matK片段长度为1 188 bp，该结果与Gilmour 等（2013）的研究结果基本一致。本研究中，matK片段在海三棱藨草及其近缘种中的物种鉴定效率为52.4%，而Clerc-Blain 等（2010）的研究结果表明matK片段能够识别出加拿大北极群岛上95%的薹草属（Carex L.）和嵩草属（Kobresia Willd.）植物，推测可能的原因是在上述研究区域内同属近缘种数目较少，实验过程中对近缘种采样不充分（Fazekas et al.，2008）。

ndhF 序列位于叶绿体基因的小单拷贝区（small single-copy region，SSC），Kim和Jansent（1995）研究表明，该序列5′端较为保守而3′端变异较大，进化速率是rbcL 基因的2倍。本研究获得的ndhF 序列长度为1 038 bp，与Gilmour等（2013）的研究结果基本相符，但该序列在海三棱藨草及其近缘种中的变异位点数远不及在水葱属和萤蔺属中，物种的鉴定效率仅为28.6%。

rbcL序列相对保守，种间变异小，因其强大的通用性而被广泛用于植物系统发育研究中。但Starr 等（2009）在使用引物rbcL-a_f / rbcL-a_r对薹草属植物的rbcL序列进行扩增和测序时，发现该序列获得率仅为18%。本研究采用1F/724R对rbcL 序列进行扩增，成功获得了rbcL片段，但序列变异率低（0.15%），远小于在韩国藨草属植物中的变异水平（Jung &Choi，2010），不能对海三棱藨草及其近缘种进行有效区分。

叶绿体tRNA基因trnL（UAA）内含子具有催化功能且存在二级结构（Kuhsel et al.，1990），因此序列变异率较低；而trnL-trnF 间隔区面临的选择压力小，进化速度快，适用于分类阶元较低的类群间的系统发育研究（Taberlet et al.，1991）。但本研究结果表明，这两条序列在海三棱藨草及其近缘种中非常保守，变异率和种间差异极小或为零，不适宜作为海三棱藨草及其近缘种鉴定的候选DNA条形码。

Starr等（2009）研究了5个DNA条形码片段（matK、rbcL、rpoC1、rpoB、trnH-psbA）在薹草属下Deweyanae组、Phyllostachyae组和Griseae组植物中的表现，结果表明，单一的DNA条形码片段的物种分辨率均不超过60%。在本研究中，单一片段在海三棱藨草及其近缘种中的鉴定效率最高为52.4%（matK），仅有11个个体被成功鉴定。这说明采用单一片段均无法对海三棱藨草及其近缘种进行有效区分。我们进一步分析了DNA条形码组合片段在海三棱藨草及其近缘种间的物种分辨率。叶绿体基因被认为是作为一个整体（连锁）遗传的，所以各区段的叶绿体序列可以直接进行联合分析。本研究发现，将2个叶绿体基因条形码序列进行组合后，物种的鉴定效率相应地提升了。matK + rbcL 和matK + ndhF 的片段组合的物种分辨率分别提升至61.9%和61.9%。这说明对DNA条形码进行联合分析能够提供更多有效信息位点，从而提高研究结果的准确性和可靠性（Fazekas et al.，2008）。被子植物的遗传背景复杂，叶绿体基因序列相对保守，进化缓慢，提供的信息位点数相对较少。Wang等（2011）研究表明核基因片段（ITS）可能与植物物种形成联系更加紧密，序列的分化速度更快，刘建全（2015）建议将叶绿体基因片段与核基因组DNA条形码一起用于植物近缘种的分类学研究。本研究发现ITS + matK 序列组合的物种鉴定效率为所有组合片段中最高（71.4%），基本上能实现对海三棱藨草及其近缘种的鉴别。综合考虑实验成本与收益、条形码通用性和物种鉴定能力等因素，我们建议将ITS + matK 序列组合作为海三棱藨草及其近缘种鉴定的最佳DNA条形码。

3.2 海三棱藨草的分类地位

海三棱藨草最初被认为是杂交起源（唐进和王发瓒，1965；Tatanov，2007）；但从形态特征来看，其“具球茎；苞片2枚、叶状、直立或散生”的特征与水葱属植物不符，而且小坚果表面的网状纹饰也与水葱属小坚果的平滑型纹饰不符，应将其归入三棱草属（Dai et al.，2010）。本研究基于联合的ITS + matK 序列构建了海三棱藨草及其近缘种的系统发育树，结果表明海三棱藨草与三棱草属的其他3个物种形成一支，明显与水葱属分开，支持率为100%。因此，本研究结果不支持将海三棱藨草作为水葱属和三棱草属的属间杂交种，支持将其归入三棱草属，这与杨梅（2010）基于ITS序列对海三棱藨草进行系统发育研究的结论相符合。另外，系统发育树结果还显示，海三棱藨草与海滨三棱草形成单系，一方面为海三棱藨草和海滨三棱草是同一个物种提供了分子证据，另一方面，本研究中海滨三棱草只有一个样品不与同种其他样品最近而与海三棱藨草最近且后验概率仅为0.09。这意味着该节点可能不存在，但不排除两个种互为单系的可能，即从分子证据上来说海三棱藨草与海滨三棱草也可能是三棱草属的两个物种。结合形态学研究和二者的生境、分布区分析可以发现，海三棱藨草与海滨三棱草在形态上几乎一致，唯有在小穗鳞片长度和下位刚毛长度上存在细微差异；二者生境一致，均为沿海沼泽或内陆湖滨及河岸；二者分布区的区系成分基本一致（吴征镒等，2010），但具体分布点差异较大，尤其是未见海三棱藨草国外分布的报道。这应该是海三棱藨草和海滨三棱草两种名长期混淆所导致的。综上认为，本研究结果不支持海三棱藨草源自三棱水葱和扁秆荆三棱种间杂交的说法（Yang et al.，2009），而应将其纳入三棱草属中；不支持Koyama（1980）提出的海三棱藨草为扁杆荆三棱的异名观点，支持海三棱藨草为海滨三棱草异名的推论（宋晨薇等，2019）。

综上所述，本研究通过对海三棱藨草及其近缘种的DNA条形码研究，一方面筛选并明确了ITS + matK 组合序列为海三棱藨草及其近缘种分辨率最高的DNA条形码片段组合，另一方面通过将分子、形态和植物地理学证据相结合，明确了应将海三棱藨草纳入三棱草属中，其应为海滨三棱草的异名，为今后海三棱藨草及其近缘种的分类学研究奠定了理论基础。本研究仅选用了6组DNA条形码候选序列进行研究，有关三棱草属植物的DNA条形码研究有待进一步展开。

致谢 感谢云南大学徐晓副教授、中国科学院上海辰山植物科学研究中心邓玲丽女士、上海汐言生态科技有限公司宋晨薇女士在标本采集过程中给予的大力帮助与支持。

参考文献