Page 25 - 《广西植物》2020年第5期

５ 期 徐祥林等: 罗汉果内生真菌多样性研究 ６ ２ １

法(Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ＪｏｉｎｉｎｇꎬＮＪ)对供试菌株进行 ＩＴＳ 碱基 种不同组织的内生真菌总定殖率为叶片(４０％) >
序列 系 统 发 育 分 析ꎮ Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ 进 行 自 展 次 数 为 茎( ３０％) > 根 ( １０％)ꎬ 分 离 率 的 变 化 规 律 为 叶
１ ０００的置信度检测ꎬ根据系统发育树中的组群关 (０.８３) >茎(０.６７) >根(０.３)ꎮ
系对菌株进行分类ꎮ 罗汉果雌雄两种植株中不同组织内生真菌的
１.４ 内生真菌的多样性指数统计分析方法 定殖率及分离率的变化规律均有很大差异ꎮ 在雌
１.４.１ 定殖率( ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｒａｔｅꎬＣＲ) 指生长内生 株中ꎬ以根中内生真菌的定殖率和分离率最高ꎬ叶
真菌的组织块数量与全部样本组织块数量百分 片中的最低ꎻ在雄株中ꎬ以叶片中的定殖率和分离
比ꎬ即 ＣＲ(％)＝ ( 生长内生真菌的组织块数 / 分离 率最高ꎬ根中的最低ꎮ

的组织块总数) ×１００ꎮ ２.２ 内生真菌的组成
１.４.２ 分离率(ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｒａｔｅꎬＩＲ) 指从样本组织块 采用不同培养基( ＰＤＡ、ＣＭＡ、ＮＧＡ) 培养内生
中得到的菌株数量与全部样本组织块数量的比 真菌ꎬ通过形态学鉴定ꎬ利用五界分类系统ꎬ根据
值ꎬ即 ＩＲ ＝ 分离得到的内生真菌菌株数量 / 分离的 «真菌词典»第 １０ 版分类系统ꎬ将 １２２ 株菌株鉴定

组织块总数ꎮ 为 ９ 个 属ꎬ 均 归 属 于 子 囊 菌 门 ( Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ )
１.４.３ 相对频率(ｒｅｌａｔｉｖｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙꎬＲＦ) 分离到某 (表 ２)ꎬ包含座囊菌纲( Ｄｏｔｈｉｄｅｏｍｙｃｅｔｅｓ) 和子囊菌
种属内生真菌的菌株数量占分离到的所有总菌株 纲( Ｓｏｒｄａｒｉｏｍｙｃｅｔｅｓ)ꎮ 其中ꎬ座囊菌纲真菌包含 ３
数量的百分数ꎬ即 ＲＦ(％) ＝ ( 某种属内生真菌菌 科、３ 属ꎬ子囊菌纲真菌包含 ６ 科、６ 属ꎮ 从 １５０ 株

株数量 / 分离到的所有内生真菌总菌株数) ×１００ꎮ 菌株中挑选 ２３ 株代表性菌株进行分子鉴定ꎬ将测
１.４.４ 多样性指数( Ｈ′) 根据 Ｓｈａｎｎｏｎ￣Ｗｅｉｎｅｒ 指 序成功的 １６ 株菌株的 ＩＴＳ 序列在 ＧｅｎＢａｎｋ 数据库
ｋ
数公式计算ꎬ即 Ｈ′ ＝ － Ｐｉ × ｌｎＰｉꎮ 式中:ｋ 指某 中进行 ＢＬＡＳＴ 比对ꎬ相关结果及 １６ 株菌株的 Ｇｅｎ￣
ｉ ＝ １
种植物或组织中内生真菌种类的总数ꎻＰｉ 某种属 Ｂａｎｋ 序列号见表 ３ꎮ 在 ＧｅｎＢａｎｋ 数据库中选取相
内生真菌的菌株数量占分离到的所有总菌株数量 似性较高且已知种属名的序列ꎬ采用 ＭＥＧＡ Ⅹ以
的百分数ꎮ ＮＪ 法构建系统进化树(图 １) 分析其同源性ꎮ 基于
１.４.５ 相似性系数( ＣＳ) 根据 Ｓｏｒｅｎｓｏｎ 系数公式 ＩＴＳ 序列的 ＢＬＡＳＴ 比对结果和系统进化聚类分析ꎬ
计算ꎬ即 ＣＳ ＝ ２ｊ/ (ａ＋ｂ)ꎮ 式中: ｊ 是两种组织中具 并结合形态学特征ꎬ将 １６ 株菌株 ＣＪ￣３￣２￣２、ＣＪ￣１０￣
有的相同内生真菌种类数ꎻａ 是一种组织中内生真 ２￣２、 ＣＧ￣６、 ＣＧ￣６￣１￣２￣２、 ＣＧ￣１０￣１￣２￣４、 ＣＧ￣１２￣１￣１、

菌的种类数ꎻｂ 是另一组织中内生真菌的种类数ꎮ ＣＧ￣１４￣２￣１、 ＣＦ￣１、 ＣＦ￣１￣１￣２、 ＣＦ￣２￣１、 ＣＦ￣６、 ＣＦ￣７￣１、
相似性系数可以比较两种组织之间内生真菌种类 ＸＪ￣１、 ＸＪ￣１￣３、 ＸＪ￣１￣４ 和 ＸＹ￣１１￣３￣１ 分 别 鉴 定 为
组成的相似程度ꎮ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ、
Ａｃｒｏｃａｌｙｍｍａ ｖａｇｕｍ、Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｓｐ.、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｔｒｕｎ￣
２ 结果与分析 ｃａｔｕｍ、Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｅｑｕｉｓｅｔｉ、Ｃｏｌｌｅ￣
ｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ、Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ ｔｅｒｒｉｃｏｌａ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ
２.１ 内生真菌定殖率和分离率 ｔｒｕｎｃａｔｕｍ、 Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ、 Ｘｙｌａｒｉａｃｅａｅ

从罗汉果的 ２１０ 个组织块中共分离得到 １５０ ｓｐ.、 Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ、 Ｐｈｏｍａ ｓｐ.、 Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ
株内生真菌( 表 １)ꎮ 其中ꎬ罗汉果雌株分离得到 ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ 和 Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ ｓｐ.ꎮ

内生真菌 ９６ 株ꎬ包括根 ４３ 株、茎 ２７ 株、叶片 ９ 株、 分子鉴定结果与形态学鉴定结果一致ꎮ 刺盘
果实 １７ 株ꎬ四种不同组织中的内生真菌总定殖率 孢属( Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ) 真菌的特征:在 ＰＤＡ 培养基
为根 ( １００％) > 茎 ( ５７％) > 果 实 ( ３０％) > 叶 片 上ꎬ菌落主要呈棉絮状ꎬ表面为墨绿色ꎬ背面为褐
(１３％)ꎬ分离率的变化规律为根(１.４３) >茎(０.９) > 色ꎻ气生菌丝为白色ꎬ常带有黑色的分生孢子器和
果实(０.５７) >叶片(０.３)ꎮ 罗汉果雄株分离得到内 棕色的孢子液ꎻ菌落生长十分迅速ꎬ２５ ℃ 恒温培养
生真菌 ５４ 株ꎬ包括根 ９ 株、茎 ２０ 株、叶片 ２５ 株ꎬ三 ７ ｄ时ꎬ 菌落直径可达 ９ ｃｍꎻ 分生孢子器的数量多ꎬ