Page 24 - 《广西植物》2020年第5期
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６ ２ ０ 广 西 植 物 ４０ 卷
瑞ꎬ２０００)ꎮ 根据共生理论ꎬ罗汉果内生真菌可具 换一种消毒剂时ꎬ均先以无菌水清洗组织块 ３ 次ꎬ
有多种生物活性功能ꎬ目前对罗汉果内生真菌的 再以无菌滤纸吸干多余水分ꎻ先以升汞溶液消毒
研究 见 有 少 量 报 道 ( 张 昌 志ꎬ ２０１８ꎻ 范 彩 琴 等ꎬ 完成后ꎬ再次以无菌水清洗组织块 ４ 次ꎮ 为确定
２０１７ꎻ蒋智ꎬ２０１５ꎻ付东兴ꎬ２０１３ꎻ陈海燕等ꎬ２０１０ꎬ 消毒是否彻底ꎬ分别设置了两组对照:其一ꎬ吸取
２０１２)ꎮ 然而ꎬ罗汉果为雌雄异株植物ꎬ对内生真 １００ μＬ 最后一次清洗组织块的无菌水至新鲜无菌
菌组成的影响可能不同ꎮ 因此ꎬ本研究首次对罗 ＰＤＡ 平板上ꎬ并以无菌涂布器涂布均匀ꎻ其二ꎬ采
汉果雌、雄株各组织中的内生真菌多样性开展研 用按压法ꎬ将消毒的组织块放至新鲜无菌 ＰＤＡ 平
究ꎬ对不同组织中的内生真菌进行分离鉴定ꎬ对内 板上ꎬ稍加按压ꎬ放置 ２０ ｍｉｎ 后移去组织块ꎬ每组
生真菌的组成进行分析比较ꎬ以期为研究内生真 处理设置 ３ 个平行ꎮ 将以上两种不同方法处理的
菌与罗汉果互作关系ꎬ以及其在罗汉果病害生物 对照放至培养箱中(２６ ± １)℃ 进行培养ꎬ观察有
防治领域的应用奠定基础ꎮ 无菌落长出ꎬ以明确组织块消毒是否彻底ꎮ 将所
有消 毒 的 组 织 块 先 置 于 含 有 硫 酸 链 霉 素 ( ５００
１ 材料与方法 μｇｍＬ ꎬ以抑制细菌的生长) 的 ＰＤＡ 平板上ꎬ每
￣１
皿放一个组织块ꎬ然后放至(２６ ± １)℃ 条件下培
１.１ 培养基 养ꎬ每天观察有无菌落长出ꎬ待有新菌落长出时ꎬ
１.１.１ 马铃薯葡萄糖琼脂培养基( ＰＤＡ) 马铃薯 将其转接至新的 ＰＤＡ 培养基ꎬ反复转接以对其进
去皮 ２００ ｇꎬ葡萄糖 ２０ ｇꎬ琼脂 ２０ ｇꎬ蒸馏水１ ０００ 行纯化ꎬ直至长出的菌落形态完全一致ꎮ 将纯化
ｍＬꎬｐＨ７.０ꎬ１２１ ℃ 高温高压灭菌 ２０ ｍｉｎꎮ 后的菌株接种至 ＰＤＡ 斜面ꎬ放置于 ４ ℃ 冰箱进行
１.１.２ 玉米粉琼脂培养基(ＣＭＡ) 玉米粉 ４０ ｇ、琼 保存ꎮ 以上操作均在无菌条件下进行ꎮ
脂 １５ ｇ ﹑蒸馏水１ ０００ ｍＬꎬｐＨ７.０ꎬ１２１ ℃ 高温高 １.３ 内生真菌的鉴定
压灭菌 ２０ ｍｉｎꎮ １.３.１ 形态学鉴定 采用不同培养基(ＰＤＡ、ＣＭＡ、
１.１.３ ＮＧＡ 培养基 葡萄糖 ２.５ ｇ、牛肉浸膏 ３.０ ｇ、 ＮＧＡ)对内生真菌进行培养ꎬ参考«真菌鉴定手册»
蛋白胨 ５.０ ｇ、琼脂 １６.０ ｇ、１２１ ℃ 高温高压灭菌ꎮ (魏景超ꎬ１９７９)、相关文献以及广西师范大学珍稀
１.２ 罗汉果及内生真菌的分离 濒危动植物生态与环境保护省部共建教育部重点
罗汉果健康植株于 ２０１７ 年 １１ 月采自中国科 实验室化学生态实验室已鉴定至属种的多种内生
学院广西植物研究所内ꎬ雌雄植株各 １ 株ꎮ 采集 真菌菌株等ꎮ 鉴定特征包括菌落大小、菌落及培
完整植株ꎬ雌株包括根、茎、叶片和果实ꎬ雄株包括 养基基质颜色、菌落形态、菌落边缘特征、菌落生
根、茎和叶片ꎮ 块根长 １３ ~ １５ ｃｍꎬ藤茎长 ２ ~ ３ ｍꎬ 长速率、菌落在显微镜下的特征( 如菌丝有无分
带深绿色叶片ꎬ果实大小约 ５ ｃｍ × ６ ｃｍꎮ 材料带 隔、分支ꎬ分生孢子形态、大小ꎬ产孢结构特征等)ꎮ
回实验室后立即进行内生真菌的分离ꎮ １.３.２ 分子生物学鉴定 利用真核生物在 ｒＤＮＡ 的
内生真菌的分离参照 Ｌｏｕ ｅｔ ａｌ.(２０１３)、王利 ＩＴＳ 区段的特性ꎬ即具保守性序列和特异性序列的
娟和贺新生(２００６) 的方法ꎬ并进行一定改良ꎮ 具 特性ꎬ通过内生真菌的 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 序列对其进行鉴
体操作如下:首先ꎬ在水龙头下以流动水将罗汉果 定ꎮ 采用十六烷基三甲基溴化铵法( ＣＴＡＢ) 提取
各组织冲洗干净ꎬ去掉表面的泥土和灰尘ꎻ然后ꎬ 内生真菌的总 ＤＮＡꎬ以真菌通用引物 ＩＴＳ１(５′￣ＴＣ￣
用吸水纸将多余水分吸干ꎬ以 ７５％酒精擦拭材料 ＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ￣３′) 和 ＩＴＳ４ ( ５′￣ＴＣＣＴＣ￣
表面ꎻ最后ꎬ将材料转至超净工作台中ꎬ以无菌剪 ＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ￣３′) 扩增菌株 ＩＴＳ 碱基序列ꎬ
刀结合解剖刀ꎬ将材料切割成大小约为 ０.５ ｃｍ × 委托北京六合华大基因科技有限公司武汉分公司
０.５ ｃｍ 的组织块ꎬ共切取 ２１０ 个组织块ꎮ 每一个 进行检测纯化及测序ꎮ 将测序得到的结果进行校
组织块均依次以 ７５％酒精消毒 ２ ｍｉｎ、２％ 次氯酸 对拼接后ꎬ登录 ＧｅｎＢａｎｋ 进行序列比对ꎬ找出相似
钠溶液消毒 ２ ｍｉｎ、０.２％升汞溶液消毒 ５ ｍｉｎꎮ 每 性高的真菌序列作为参考ꎬ采用 ＭＥＧＡ Ⅹ以邻接
