Page 86 - 《广西植物》2020年第5期

６ ８ ２ 广 西 植 物 ４０ 卷
对象ꎬ其来源省份见表 １ꎮ 以植物鲜嫩叶片为材料ꎬ 核悬液样品上机检测ꎬ采用 ４８８ ｎｍ 的激光激发ꎬ
标准植物水稻‘日本晴’(Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ. ｊａｐｏｎｉｃａ 收集 ６７０ / ３０ 通道的荧光ꎬ检测荧光强度ꎮ 每个待
‘Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ’ꎬ ２Ｃ ＝ ０.７９５)(Ｓａｓａｋｉ ＆ Ｂｕｒｒꎬ ２０００)为 测样品收集约 １０ ０００ 个细胞ꎬ每管样品测试 ３ 次ꎬ
内部标样ꎮ 并在不同日期进行 ２ 次重复ꎬ取平均值计算ꎮ
使用 仪 器 自 带 软 件 进 行 作 图 分 析ꎮ 已 知 核
表 １ 乌饭树单株的地理来源 ＤＮＡ 含量的水稻‘ 日本晴’ 的实生幼苗为参照样
Ｔａｂｌｅ １ Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ ｐｌａｎｔｓ
本ꎬ按照以下公式计算得到待测样品的核 ＤＮＡ 含
省份 城市 编号
量ꎬ 其 中 Ｇ / Ｇ 峰 的 变 异 系 数 ( ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ
Ｐｒｏｖｉｎｃｅ Ｃｉｔｙ Ｓａｍｐｌｅ Ｎｕｍｂｅｒ ０ １
ｖａｒｉａｔｉｏｎꎬＣＶ ＝ 标准差 / 平均值 × １００％) ＣＶ 值大于
江苏 宜兴 １
Ｊｉａｎｇｓｕ Ｙｉｘｉｎｇ ５％ 的 结 果 予 以 舍 弃 ( Ａｒｕｍｕｇａｎａｔｈａｎ ＆ Ｅａｒｌｅꎬ
溧阳 ４ꎬ５ １９９１ａ)ꎮ 并根据 １ ｐｇ ＤＮＡ ＝ ９７８ Ｍｐꎬ计算乌饭树
Ｌｉｙａｎｇ
无锡 ６ 的基因组大小ꎮ
Ｗｕｘｉ
湖南 常德 ２
Ｈｕｎａｎ Ｃｈａｎｇｄｅ ２ 结果与分析
白云山 ３
Ｂａｉｙｕｎｓｈａｎ
２.１ 解离液的选择
江西 赣州 ７ꎬ８ꎬ９
Ｊｉａｎｇｘｉ Ｇａｎｚｈｏｕ
由于不同解离液对不同植物的解离效果存在
明显差异ꎬ在乌饭树核 ＤＮＡ 含量检测前ꎬ比较 ５ 种
１.２ 标本制作 植物常用的解离液( ＬＢ０１、Ｇａｌｂｒａｉｔｈ’ ｓ、ＷＰＢ、ＧＰＢ
１.２.１ 解离液选择与荧光染料配制 采用 ＬＢ０１、 和 Ｔｒｉｓ￣ＭｇＣｌ ) 对乌饭树叶片的解离 效 果ꎮ 发 现
２
Ｇａｌｂｒａｉｔｈ’ｓ、ＷＰＢ、ＧＰＢ 和 Ｔｒｉｓ￣ＭｇＣｌ ５ 种配方进行 ＧＰＢ 解离液对乌饭树和水稻叶片细胞核的解离效
２
试验ꎬ找出测定乌饭树基因组的最佳解离液配方ꎮ 果最佳ꎬ其细胞核悬液的浓度较高ꎬ上机检测能得
￣１
配制碘化 丙 啶 ＰＩ 染 色 液 ( ５０ μＬ∙ ｍＬ ꎬ含 ＲＮＡ 到较好的荧光信号:噪音少、峰形佳、面积相对较
酶)ꎬ４ ℃ 保存ꎮ 大ꎬ变异系数控制在 ５％以内ꎮ 因此ꎬ本研究采用
１.２.２ 细胞核悬液制备与 ＤＮＡ 特异性染色 制备 ＧＰＢ 解离液制样进行测试ꎮ

待测样、标样、待测样 ＋ 标样混合的细胞核悬液ꎮ ２.２ 待测样品的荧光强度范围确定
取待测样品和标样嫩叶各 ５０ ｍｇꎬ一起放入置于冰 为了控制试验误差ꎬ试验采用内标法进行测
上的塑料平皿中ꎬ加入 １ ｍＬ 预冷的解离液ꎬ用锋 定ꎬ经查询、比较常用的植物标样和部分越橘属植
利刀片迅速切碎叶片ꎮ 使用移液枪吸取塑料平皿 物的 ２Ｃ￣值后ꎬ选择水稻‘ 日本晴’ 作为标准样品ꎮ
中的解离液(弃去碎材料)ꎬ置于 １.５ ｍＬ ＥＰ 管ꎬ用 以水稻‘日本晴’、乌饭树样本单独上机检测ꎬ通过
孔径为 ４０ μｍ 无菌注射式过滤器过滤ꎬ得滤液至 观察流式细胞术检测图中峰的位置ꎬ初步确定标
￣１
新管内ꎬ置于冰上孵育 ５ ｍｉｎꎮ ４ ℃ ꎬ８００ ｒｍｉｎ 样与待测样本的荧光强度范围ꎮ 在同一检测模板
离心 ５ ｍｉｎꎬ小心吸取上清置于新管中ꎮ 再加入 下ꎬ水稻‘日本晴’ 的荧光强度峰值在 １０ ０００ 附近

５００ μＬ 配置好的 ＰＩ￣Ｒｎａｓｅ 染液ꎬ避光染色 ５ ~ １０ (图 １)ꎬ乌饭树的荧光强度峰值在 １７ ０００ 附近(图
ｍｉｎꎮ 另取待测样品、标样的嫩叶各 ５０ ｍｇꎬ按照同 ２)ꎮ 由于细胞核的荧光强度与核 ＤＮＡ 含量成正

样的方法分别备至细胞核悬液作为空白对照ꎬ空 比ꎬ说明水稻‘ 日本晴’ 的核 ＤＮＡ 含量小于乌饭
白对照以同样的方法进行染色ꎮ 将染色的细胞核 树ꎻ同时可以推测ꎬ在下一步混合样本的流式细胞
悬液转入标准上样管中ꎬ上机测定ꎮ 术检测图中ꎬ代表水稻的峰应位于流式细胞术检
１.３ 流式细胞仪检测及分析 测图的左侧ꎬ而代表乌饭树样品的峰应位于图的
利用 ＢＤ Ｉｎｆｌｕｘ 流式细胞仪对染色后的细胞 右侧ꎮ
ＴＭ