Page 182 - 《广西植物》2021年第4期

ᤃ ᤃ ࿗ 广জ 西জ 植জ 物 ࿗ϟ 卷
同时设计一对 ጢࣕ端包含 ԰ϟ ᤦᡱ 线性化载体同源序
列的 引 物 ྉ 表 ϟɯᖔ 使用该引物对 ÞቂȣዛԮϟ 进行
۪ऊ኏ᖔ将目的基因与载体温浴连接ᖔ并将连接好的
载体热激转入 ఋϟ 全式金大肠杆菌感受态细胞进

行培养ᖔ进行测序鉴定ᖔ得到 èቝȮዶԻϟ᥋ᡱ኏ᨃ᣽԰᥋᥈В୩
过表达载体ᤥ

表 ϓই ÞቂȣዛԮϓ 基因克隆及载体无缝
克隆 ۗࣷቴ 引物名称及序列
ఋᑕᤦ᤟ᔀ ϟজ ۪ऊ኏ ᡱʢᔽቝᔀʢ Ⴟᑕቝᔀ༁ ᑕႿʛ ༁ᔀीࣼᔀႿዹᔀ༁ ᆍ஦ ÞቂȣዛԮϟ
੫ᔀႿᔀ ዹ᤟ᆍႿᔽႿ੫ ᑕႿʛ ׹ᔀዹᡷᆍʢ ༁ᔀᑕቝ᤟ᔀ༁༁ ዹ᤟ᆍႿᔽႿ੫
引物名称 引物序列
۪ʢᔽቝᔀʢ Ⴟᑕቝᔀ ۪ʢᔽቝᔀʢ ༁ᔀीࣼᔀႿዹᔀ

èቝȮዶԻϟ᥋è ጢࣕ ዶఋ᥈᥈᥈ఋఋऊዶఋऊ᥈᥈ዶዶዶఋఋዶఋዶ᥈ዶఋఋ ሕࣕ
èቝȮዶԻϟ᥋኏ ጢࣕ ఋऊዶዶఋఋఋ᥈ዶዶ᥈ఋఋ᥈᥈᥈ఋዶఋఋ᥈ዶ᥈᥈ዶ ሕࣕ
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᥈ఋዶఋఋ᥈ዶ᥈᥈ዶ᥈ऊ ሕࣕ

图 ϟজ 构建 èቝȮዶԻϟ᥋ᡱ኏ᨃ᣽԰᥋᥈В୩ 过表达载体原理图
ϓॹԣ 对水曲柳组培苗进行瞬时侵染 èᔽ੫঎ ϟজ ୩ዹၤᔀቝᑕᡷᔽዹ ʛᔽᑕ੫ʢᑕቝ ᆍ஦ዹᆍ༁ᡷʢࣼዹᡷᔽႿ੫ èቝȮዶԻϟ᥋ᡱ኏ᨃ᣽԰᥋᥈В୩
ᆍ׹ᔀʢᔀ଴ᡱʢᔀ༁༁ᔽᆍႿ ׹ᔀዹᡷᆍʢ
ϟ঎԰঎ ϟ 三亲杂交转化农杆菌 জ 将含有 èቝȮዶԻϟ᥋
ᡱ኏ᨃ᣽԰᥋᥈В୩ܦ空载的大肠杆菌菌液分别同 ̀ᔀ᤟ᡱᔀʢ
菌液和 ᓂାዶ࿗࿗ԡ࿗ 农杆菌菌液在不含抗性的液体 ϓॹᇺ ÞቂȣዛԮϓ 及茉莉酸通路相关调控基因的荧光
ᓂା 培养基中 ԰ऐ ቩ 培养 ԰࿗ ၤ 进行杂交ᖔ取杂菌在 定量 ۗࣷቴ
含有 ኏ᔽ஦ᑕቝᡱᔽႿ 和 ᣽ᑕႿᑕ 抗性的液体培养基 ԰ऐ ቩ 培 首先在侵染后 ሕᤃ ၤ 使用茉莉酸合成途径抑制

养 ԰࿗ ၤ 培养进行筛选ᖔ对得到的杂菌进行菌液 剂ྉ᧕᧧ጶऊዶɯ对完成瞬时侵染的水曲柳组培苗进行
۪ऊ኏ 验证ᖔ 最终得到分别含有空载和 èቝȮዶԻϟ᥋ 喷施处理ᖔ将两种处理过的侵染苗分别设置 ԡܦϟܦሕܦ
ᡱ኏ᨃ᣽԰᥋᥈В୩ 载体的农杆菌ᤥ ᤃܦϟऐܦ԰ϟܦ԰࿗ ၤ Ꭾ 个时间点进行取样ྉ取整株 ϟԡ ዹቝ
ϟ঎԰঎԰ 水曲柳 ÞቂȣዛԮϟ 瞬时侵染জ 设计对照组和实 水曲柳组培苗为样品ɯᖔ每个时间点设置三组平行
验组ᖔ其中对照组使用含有空载的农杆菌侵染水 实验ᖔ每三株为一组ᖔ留一组不进行处理ᤥ 取样时
使用液氮进行冷冻并置于ͱऐԡ ቩ 冰箱保存ᖔ待所有
曲柳 组培苗ᖔ 实验组使用含有 èቝȮዶԻϟ᥋ᡱ኏ᨃ᣽԰᥋
᥈В୩ 载 体 的 农 杆 菌侵染水曲柳组培苗ᖔ 选用 实验组取样完毕后ᖔ 使用 ఋʢᔽ༁᥋ዹఋዶା 法提取样品

ᨃ᧕ᤃԡԡ 值为 ϟ঎ ԡ 的农杆菌与乙酰丁香酮浓度为 ኏શዶᖔ对 ኏શዶ 进行反转录ᖔ选取水曲柳微管蛋白基
᥋ϟ
ϟ԰ԡ ဂቝᆍ᤟ኼᓂ 的 ۼ۪ᥘ 培养基置于摇床上共培养 ԰ 因 Þቂ௴І 为内参对 Ꭾ 个时间点的 ÞቂȣዛԮϟܦÞቂȣዛԮ԰ܦ
ၤ 进行侵染ྉ徐威等ᖔ԰ԡԡሕଫᓂᔽ ᔀᡷ ᑕ᤟঎ᖔ԰ԡԡँଫȮᔀ༁༁ᔽዹᑕ ᔀᡷ ᤩᒦϟܦጛᧇટሕܦ᤹ɔࣷ԰ 表达进行荧光定量 ۪ऊ኏ᤥ
ᑕ᤟঎ᖔ԰ԡϟ࿗ଫ梁童瑶ᖔ԰ԡϟጢɯᤥ 在侵染前将选好的水曲 ϓॹ྽ 材料
柳组培苗置于质量分数为 ԰ጢᠮ蔗糖高渗溶液中浸 菌种᧥ఋϟ 全式金感受态细胞ܦᓂାዶ࿗࿗ԡ࿗ 农杆
泡 ϟԡ ቝᔽႿᖔ提高组培苗韧性ᖔ减少操作过程中组培 菌ܦ̀ᔀ᤟ᡱᔀʢ 菌ᤥ 试剂盒和工 具 酶᧥ 南京诺唯赞
苗的损耗ᤥ 将侵染结束的组培苗置于 ۼ۪ᥘ 培养 ऊ᤟ᆍႿጶ଴ᡱʢᔀ༁༁ ᗀ В᤟ᡷʢᑕ ᨃႿᔀ ୩ᡷᔀᡱ ऊ᤟ᆍႿᔽႿ੫ ᣽ᔽᡷ 试剂盒ܦ

基继续培养ᤥ ఋʢᑕႿ༁୩ዹʢᔽᡱᡷ ዶ᤟᤟᥋ᔽႿ᥋ᨃႿᔀ èᔽʢ༁ᡷ᥋୩ᡷʢᑕႿʛ ዹ᧕શዶ ୩ᢃႿᡷၤᔀ༁ᔽ༁