Page 154 - 《广西植物》2023年第1期
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１ ５ ０ 广 西 植 物 ４３ 卷
究拟对广西钦州市夹竹桃中的内生真菌进行分离 １.５ ＩＴＳ ｒＤＮＡ 序列分析
鉴定和抗菌活性筛选ꎬ以确定夹竹桃内生真菌多样 提取内生真菌的 ＤＮＡ 后ꎬ用真菌鉴定通用引物
性究竟如何ꎬ有哪些内生真菌类型及其在不同组织 ＩＴＳ１ ( ５′￣ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ￣３′) 和 ＩＴＳ４
的分布情况ꎬ以期能够获得一些具有抗水产病原弧 (５′￣ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ￣３′) 扩 增 真 菌 ＩＴＳ
菌活性的菌株ꎬ为进一步开发新型的抗菌剂奠定 ｒＤＮＡ 序列ꎮ ＰＣＲ 反应体系:ｄｄＨ Ｏ ２０ μＬꎬ２ ×Ｔａｑ
２
基础ꎮ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ ２５ μＬ (北京索莱宝生物科技有限公
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司)ꎬ１０ μｍｏｌＬ 的引物各 ２ μＬꎬ１０ ｎｇμＬ 模板 １
１ 材料与方法 μＬꎮ 反应程序:９４ ℃预变性 ４ ｍｉｎꎬ９４ ℃ 变性 ３０ ｓꎬ
５７ ℃退火 ３０ ｓꎬ７２ ℃ 延伸 ３０ ｓꎬ３０ 个循环ꎬ７２ ℃ 延
１.１ 样品采集和预处理 伸 １０ ｍｉｎꎮ 引物合成和测序都由北京六合华大基因
夹竹桃样品采集于广西钦州市钦北区ꎬ经钦 科技有限公司完成ꎮ 将获得的序列用 ＢＬＡＳＴ 程序
州市中医院中药研究所朱开昕高级工程师鉴定为 在 ＧｅｎＢａｎｋ 数据库中进行同源性检索ꎬ比对得出与
夹竹桃属夹竹桃( Ｎｅｒｉｕｍ ｏｌｅａｎｄｅｒ)ꎮ 选取健康夹 其相似性最高的核酸序列ꎮ 通过 ＭＥＧＡ７.０ 软件使
竹桃的新鲜茎段和叶组织块ꎬ用自来水冲洗表面 用邻接法构建系统发育树ꎮ
的泥土和灰尘ꎬ在无菌操作台中进行表面消毒:先 １.６ 内生真菌次生代谢产物的提取和抑菌活性的测定
将样品浸泡在 ７５％酒精中 ３ ~ ５ ｍｉｎꎬ再转入 ３％ ~ 接种分离真菌于 １００ ｍＬ 液体 ＰＤＡ 培养基ꎬ于
５％的次氯酸钠溶液中浸泡 ３０ ｓꎬ然后再用无菌水 ２６~２８ ℃在 ２００ ｒｍｉｎ 转速下培养 １０ ~ ２０ ｄ 至菌
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冲洗干净ꎮ 在超净操作台中放到干燥灭菌的培养 丝体长满三角瓶ꎻ８ ０００ ｒｍｉｎ 离心收集菌丝体ꎬ２０
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皿中晾干ꎬ备用ꎮ ℃下吹干水分ꎻ称取 ０.３ ｇ 干燥后的菌体加入 ５ ｍＬ
１.２ 内生真菌分离和纯化 提取液(乙酸乙酯 ∶ 甲醇 ∶ 乙酸 ＝ ８０ ∶ １５ ∶ ５)浸泡ꎬ
将上述处理过的茎段和叶片组织用无菌剪刀 然后将提取液静置挥发ꎬ加入 ５００ μＬ 乙酸乙酯溶解
剪成 ５ ｍｍ× ５ ｍｍ 小块后ꎬ贴于 ＰＤＡ 培养基平板 提取物ꎮ 抑菌活性指示菌蜡样芽孢杆菌( Ｂａｃｉｌｌｕｓ
上ꎻ置于 ２８ ℃ 恒温培养箱倒置培养 ２ ~ ４ ｄꎬ并定期 ｃｅｒｅｕｓ)、金黄色葡萄球菌 ( Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ) 、
观察真菌的生长情况ꎻ得到生长状况良好的菌株ꎻ 魔鬼弧菌(Ｖｉｂｒｉｏ ｄｉａｂｏｌｉｃｕｓ) 由本实验室购买保藏ꎻ
待组织边缘发现有菌丝长出时ꎬ在无菌环境下挑 溶藻弧菌(Ｖ. ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ)、坎氏弧菌(Ｖ. ｃａｍｐｂｅｌｌｉｉ)
取菌丝尖端转接到纯化培养基平板上ꎻ经多次分 分离自患病的鱼虾ꎮ 分别接种到 ＬＢ 液体培养基
离纯化后再接种于 ＰＤＡ 斜面作为保种ꎬ保存在 中ꎬ３０~３５ ℃ 摇床上以 ２００ ｒｍｉｎ 的转速培养过
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４ ~ ８ ℃ 冰箱备用ꎮ 夜ꎮ 将上述菌液 ２００ μＬ 采用混菌法接种于培养皿
１.３ 形态学鉴定 中ꎬ采用滤纸片法测定抑菌活性ꎬ观察抑菌圈的有
将分离菌株接种于 ＰＤＡ 培养基平板中ꎬ放置于 无及大小ꎬ 测量并记录抑菌圈直径 ( Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ
２８ ℃ 培养箱中培养ꎮ 在各菌株生长的最佳时期ꎬ对 ２０１８)ꎮ 该实验使用滤纸片蘸取乙酸乙酯作为空白
照«真菌鉴定手册»(魏景超ꎬ １９７９)ꎬ观察菌落形态 对照ꎬ阳性对照为滤纸片蘸取 ５０ μｇｍＬ 的卡那霉
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(菌落颜色、大小、性状及边缘等)、生长情况、菌丝 素和氯霉素ꎮ
体、孢子的形态特征和表面特征ꎬ拍照记录ꎮ
１.４ ＤＮＡ 提取 ２ 结果与分析
菌丝体用液氮研磨至匀浆状ꎬ再加入 ６００ μＬ
的 ＣＴＡＢ 提 取 液ꎬ６５ ℃ 水 浴 ４５ ｍｉｎꎬ１２ ０００ ｒ ２.１ 内生真菌的形态学鉴定
ｍｉｎ 离心 ５ ｍｉｎꎬ取上清液ꎻ加入苯酚 ∶ 氯仿 ∶ 异 如图 １ 所示ꎬ根据菌株的菌落、菌丝体和孢子
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戊醇混合液( ２５ ∶ ２４ ∶ １)ꎬ混匀后 ４ ℃ 条 件 下ꎬ 的形态特征ꎬ对照«真菌签定手册» 进行初步鉴定ꎬ
￣１ 分属于 ７ 个属ꎮ 其中ꎬ叶部组织获得 １２ 株菌ꎬ占
１０ ０００ ｒｍｉｎ 离心 ５ ｍｉｎꎻ取上清液ꎬ加入－２０ ℃
预冷的异戊醇静置数分钟ꎻ室温 １２ ０００ ｒｍｉｎ 离 ６３.１６％ꎬ分属于炭疽菌属( Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐｐ.)、球
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心 ５ ｍｉｎꎬ去上清液ꎻ取沉淀ꎬ用 ７５％乙醇洗沉淀ꎬ 座菌 属 ( Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ ｓｐｐ.)、 叶 点 霉 属 ( Ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａ
加 ５０ μＬ 无菌水ꎬ－２０ ℃ 保存备用ꎮ ｓｐｐ.)、 新壳梭孢属 ( Ｎｅｏｆｕｓｉｃｏｃｃｕｍ ｓｐ.) 和曲霉属
