Page 41 - 《广西植物》2023年第11期

１１ 期 李王靖等: 茅尾海红树根际土壤可培养细菌多样性及抑菌活性研究 ２ ０ ０ １

榄、黄槿、无瓣海桑、桐花树、阔苞菊的根际泥土样 １０ 培养基、酪氨酸 － 天冬酰胺培养基( Ｐ７)、改良
本ꎮ 采集 ５ ~ １０ ｃｍ 深度的红树植物根际土壤ꎬ除 ＩＳＰ５ 培 养 基 ( Ｍ７)、 Ａｍ６￣１ 培 养 基、 燕 麦 培 养 基
去石块和断根等杂质后装入无菌采样袋存放于 (Ｐ３)ꎮ 灭 菌 后 添 加 重 铬 酸 钾 使 其 终 浓 度 为 ２５
￣１
４ ℃ 保温箱中ꎬ带回实验室进行菌株分离实验ꎮ 样 ｍｇＬ ꎮ 纯化及保藏培养基:ＩＳＰ２ 和 ＬＢ 固体培
品采集信息详情如表 １ 所示ꎮ 养基ꎮ 发酵培养基:ＡＭ３ 和 ＡＭ６ 液体培养基ꎮ 检
定菌培养基:ＬＢ 固体培养基ꎮ
表 １ 茅尾海红树根际土壤样品采集的信息 １.２ 方法
Ｔａｂｌｅ １ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｍａｎｇｒｏｖｅ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ １.２.１ 土壤样品的处理 参照王肖慢等(２０１９) 的
ｓｏｉｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｍａｏｗｅｉ Ｓｅａ 方法ꎬ取 ２０ ｇ 土壤加入灭菌后的 ５００ ｍＬ 液体富集

样品编号 经度和纬度 培养基(Ｍｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１８) 中ꎬ震荡混匀ꎬ置于 ２８ ℃
根际土壤样品
Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｌｏｎｇｉｔｕｄｅ ａｎｄ
Ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ ｓａｍｐｌｅ 恒温箱静置培养ꎬ分别于第 ０ 天和第 ７ 天取原液、
ｓａｍｐｌｅ ｌａｔｉｔｕｄｅ
１０ 和 １０ 稀释液ꎬ在 ６ 种不同的分离培养基上涂
￣３
￣１
Ａ 红海榄根际土壤 １０８°３４′４３″ Ｅ、
Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ ｓｔｙｌｏｓａ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ ２１°５２′１０″ Ｎ 布培养(李蜜等ꎬ２０２０)ꎮ
Ｂ 黄槿根际土壤 １０８°３５′２５″ Ｅ、 １.２. ２ 菌 株 的 分 离 纯 化 和 保 藏 参 考 李 蜜 等
Ｔａｌｉｐａｒｉｔｉ ｔｉｌｉａｃｅｕｍ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ ２１°５１′３８″ Ｎ
(２０２０)的方法ꎬ将涂布后的培养基置于 ２８ ℃ 恒温
Ｃ 无瓣海桑根际土壤 １０８°３５′４５″ Ｅ、
Ｓｏｎｎｅｒａｔｉａ ａｐｅｔａｌａ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ ２１°５１′３７″ Ｎ 培养箱培养ꎬ分别于第 ５、第 １７、第 ４１ 天从涂布培
Ｄ 无瓣海桑根际土壤 １０８°３４′４４″ Ｅ、 养基中挑选单一菌落ꎬ采用三区划线法在 ＩＳＰ２ 培
Ｓ. ａｐｅｔａｌａ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ ２１°５２′０９″ Ｎ
养基上分离纯化ꎬ编号且记录其生长培养基类型
Ｅ 桐花树根际土壤 １０８°３４′４４″ Ｅ、 和形态特征ꎻ将纯化的菌株保藏于 ２５％( Ｍ / Ｍ) 无
Ａｅｇｉｃｅｒａｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ ２１°５２′３５″ Ｎ
ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ 菌甘油管中ꎮ
Ｆ 桐花树根际土壤 １０８°３４′４３″ Ｅ、 １.２.３ 菌株的鉴定 纯化的菌株根据形态特征进
Ａ. ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ ２１°５２′１０″ Ｎ
行排重ꎬ采用 Ｃｈｅｌｅｘ￣１００ 法(周双清等ꎬ２０１０) 对已
Ｇ 阔苞菊根际土壤 １０８°３４′５２″ Ｅ、
Ｐｌｕｃｈｅａ ｉｎｄｉｃａ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ ２１°５２′０５″ Ｎ 排重细菌的基因组 ＤＮＡ 进行提取ꎬ参照 Ｗａｌｓｈ 等
(１９９１)的 方 法 对 细 菌 基 因 组 ＤＮＡ 进 行 ＰＣＲ 扩
增ꎮ 将扩增产物委托生工生物工程(上海) 股份有
１.１.２ 检定菌来源 表皮葡萄球菌( Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
限公司进行测序ꎮ 经 ＳｅｑＭａｎ 软件整理１６Ｓ ｒＲＮＡ
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ) 和 铜 绿 假 单 胞 菌 ( Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
基因 测 序 结 果ꎬ 并 在 数 据 库 ＥｚＢｉｏＣｌｏｕ ( ｈｔｔｐ: / /
ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ)由广东省微生物研究所提供ꎮ 耐甲氧
ｗｗｗ. ｅｚｔａｘｏｎ. ｏｒｇ / ) 进 行 相 似 性 比 对ꎬ 根 据 １６Ｓ
西 林 金 黄 色 葡 萄 球 菌 ( Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔ
ｒＲＮＡ 相似度对菌株的种属进行确定ꎮ
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ)由广西中医药大学海洋药物
１.２.４ 可培养细菌活性筛选
研究院提供ꎮ １.２.４.１ 可培养细菌粗提物的提取 参考李蜜等
１.１.３ 主要试剂及仪器设备 二甲基亚砜( ＤＭＳＯ)
(２０２０)的方法ꎬ将对数生长期的菌株分别接种于
和甲醇为国产分析纯ꎬ购于西陇科学股份有限公
１００ ｍＬ 的 ＡＭ３ 和 ＡＭ６ 液体培养基中ꎬ在 ２８ ℃ 、
司ꎻ聚合酶链式反应引物(２７Ｆꎬ １４９２Ｒ) 购于北京 １８０ ｒｍｉｎ 恒温振荡培养箱中发酵 ７ ｄꎮ 用等体
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全式金生物技术有限公司ꎻＣｈｅｌｅｘ￣１００ 树脂购于美 积的乙酸乙酯萃取发酵液 ３ 次ꎬ取乙酸乙酯萃取
国 ＢｉｏＲａｄ 公司ꎻＴａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ (２ ×)购于康 溶液进行减压旋蒸ꎬ挥干得到细菌粗提物ꎬ粗提物
为世纪生物科技股份有限公司ꎮ
置于 ４ ℃ 环境保存ꎮ
１.１.４ 培养基 富集培养基:氯化铵 １.０ ｇꎬ乙酸钠 １.２.４.２ 细菌粗提物的抑菌实验 参考郑红芸等
２.０ ｇꎬ七水硫酸镁 ０.２０ ｇꎬ酵母提取物 ０.２０ ｇꎬ蛋白 (２０１９)的方法ꎬ将致病菌接种于 ５０ ｍＬ ＬＢ 液体培
胨 ０.２０ ｇꎬＥＤＴＡ￣Ｎａ １.０ ｇꎬ丙酮酸钠 １.１ ｇꎬ海水 １ 养基中ꎬ在 ３７ ℃ 、１８０ ｒｍｉｎ 的摇床中培养 ７ ｈ 获
￣１
２
Ｌꎬ灭菌后另加无菌的 １０％ ＮａＨＣＯ 和 ２％ ＫＨ ＰＯ 得种子液ꎮ 种子液加到未凝固的 ＬＢ 固体培养基
３ ２ ４
溶液( １０ ｍＬ Ｌ )ꎮ 分 离 培 养 基: 参 考 李 蜜 等 中灭菌后冷却至 ５０ ℃ 左右的 ＬＢ 固体培养基中ꎬ
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(２０２０) 使用 ２２１６Ｅ 琼脂培养基(２２１６Ｅ)、２２１６Ｅ / 稀释至 ０.２％浓度ꎮ 充分振摇后倾注到培养皿中ꎬ