Page 182 - 《广西植物》2023年第5期
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5 期                   任雨敏等: 大叶桉挥发物对蚕豆细胞毒性效应及信号调节                                            9 4 9

            健康生长ꎮ 当挥发性化感物质释放到环境后ꎬ大                             (≥99%) 和 桉 油 精 ( ≥99%) 购 自 科 赛 斯 特 ( 成
            部分挥发到空气中作用于植物的地上部分ꎬ小部                              都)科技有限公司ꎮ
            分会通过土壤吸附、淋溶、根系分泌等途径进入土                             1.2 试验方法

            壤ꎮ 保卫细胞构成了物质进出植物体的门户———                                A 组:参照周健等(2017) 的方法培养蚕豆幼
            气孔ꎬ而根边缘细胞则是根系和土壤之间的屏障ꎬ                             苗ꎬ待幼苗生长 3 ~ 4 周时ꎬ取顶端第 1 ~ 2 对完全
            二者无疑是挥发性化感物质作用的首要靶标ꎮ 受                             展开的叶片ꎬ用蒸馏水冲洗干净ꎬ选取非叶脉部位
            体如何响应化感物质是一个十分复杂的问题ꎬ高                              用镊子撕取 1 cm × 0.5 cm 的叶下表皮条ꎬ浸泡于
            等植物机体由多细胞构成ꎬ每一种细胞的生命活                              盛有 MES 缓冲液的 EP 管中ꎮ
            动均会受机体其他细胞制约ꎮ 显然ꎬ以单细胞模                                 B 组:选取大小均匀且饱满的健康蚕豆种子
            式系统作为研究化感作用的对象ꎬ可以排除其他                              (赵红梅和王慧阳ꎬ2017)ꎬ在 0.5% KMnO 溶液中
                                                                                                     4
            细胞生命活动的干扰ꎮ 近年来ꎬ学者们逐渐关注                             浸泡 15 minꎬ冲洗干净后置于(25±1)℃ 培养箱中ꎬ

            到根边缘细胞( Latif et al.ꎬ 2017ꎻMa et al.ꎬ 2020ꎻ        黑暗条件下浸种 24 h 后均匀置于垫有湿润纱布的
            Xie et al.ꎬ 2021)和保卫细胞( 周健等ꎬ2017) 对化               瓷盘中ꎬ覆盖一层浸湿的纱布ꎬ继续培养至种子露
            感胁迫的响应及其机制ꎮ 与以整个植株作为受试                             白ꎮ 选取长势一致的露白种子ꎬ均匀置于垫有 2
            靶标相比ꎬ保卫细胞和根边缘细胞不仅具有反应                              层滤纸的培养瓶(直径 6.8 cm、高度 9.2 cm) 中ꎬ每
            灵敏、取材方便、易于控制试验条件、耗费少、周期                            瓶 3 颗ꎮ
            短等优势(周健等ꎬ2017ꎻWang et al.ꎬ 2019)ꎬ而且                    处理母液的制备:参照孟巧巧等(2020) 的水
            能够直观地洞察到化感作用这一自然现象的本                               蒸气蒸馏法提取大叶桉挥发油ꎬ得率为 0.43%ꎬ质
            质ꎮ 然而ꎬ保卫细胞和根边缘细胞如何响应大叶                             量浓度为 836.667 mgmL ꎬ采用 GC ̄MS 法确定
                                                                                         ̄1
            桉挥发物的化感效应却鲜有报道ꎮ                                    挥发 油 主 要 成 分 α ̄蒎 烯 ( ≥99%) 和 桉 油 精 ( ≥
                 大叶桉功能多样化可应用于医药(兰宏伟等ꎬ                          99%)的含量ꎮ 用二甲基亚砜( DMSO) 作助溶剂配
            2020)、生态(田雪晨和陈贤兴ꎬ2014)、农业( 刘红                      制浓度为 0.1 μLμL 的大叶桉叶挥发油母液ꎻ根
                                                                                    ̄1
            芳和邸仕忠ꎬ2018) 等领域ꎬ而现有研究偏重于大                          据 α ̄蒎烯和桉油精在挥发油中的含量ꎬ其处理母
            叶桉挥发性成分的药理作用ꎬ极少关注其种植对                              液浓度分别设置为 0.419 1、0.076 8 μLμL ꎮ
                                                                                                        ̄1
            生境内其他植物的毒害作用ꎮ 为进一步挖掘大叶                             1.3 试验处理及指标测定
            桉挥发性成分的化感作用ꎬ本研究以其挥发油及                              1.3.1 遗传毒性试验  分别取处理母液 1、2、3、4、5
            主要成分 α ̄蒎烯和桉油精为供体ꎬ以中国大叶桉                            μLꎬ均匀涂抹在 B 组培养瓶盖中部并旋紧瓶盖ꎬ置
            种植区广泛分布的农作物蚕豆( Vicia faba) 为受                      于(25 ± 1)℃ 的培养箱中避光培养 24、48、72 hꎬ
            体ꎬ以叶保卫细胞、根边缘细胞和根尖细胞为靶                              以未涂抹挥发物的处理作为对照ꎬ每处理重复 5
            标ꎬ运用蚕豆根尖微核技术、光学显微镜技术、细                             次ꎬ处理结束后测定参数ꎮ
            胞化学技术和 qRT ̄PCR 技术ꎬ在评估大叶桉挥发                             根长测定:将根尖用蒸馏水洗净ꎬ用滤纸吸干
            物化感效应及其对根尖有丝分裂行为影响的基础                              水分ꎬ用 直 尺 测 量 根 长ꎬ 每 个 处 理 作 15 个 平 行
            上ꎬ进一步分析蚕豆叶保卫细胞和根边缘细胞对                              测定ꎮ
            大叶桉挥发物的响应及其信号机制ꎬ以期从细胞                                  有丝分裂指数和微核率测定:待处理结束后
            学角度揭示大叶桉化感作用机制ꎬ为大叶桉种植                              更换干净的培养瓶盖ꎬ继续恢复培养 24 h 后ꎬ截取

            区的科学种植和管理提供理论依据ꎮ                                   长约 0. 5 cm 的根尖ꎬ用卡诺固定液固定 24 h、1
                                                               molL HCl 60 ℃ 解离 8 min、改良苯酚品红染液
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            1  材料与方法                                           染色ꎬ压片ꎬ用 Nikon E200 摄影显微镜镜检且拍
                                                               照ꎮ 每个根尖计数 1 000 个细胞ꎬ每个处理 5 个根
            1.1 试验材料                                           尖ꎮ 计算微核率( micronucleus frequencyꎬMCN) 和
                 所用材料大叶桉的叶采自四川师范大学校区                           有丝分裂指数(mitotic indexꎬMI)ꎮ 计算公式如下:
            及其附近街道ꎻ蚕豆的种子( 成胡 14#) 购自成都                             MCN = (微核数 / 观测细胞数) ×1000‰ꎻ
            市龙泉驿区大面镇街道种子市场ꎻ标准品 α ̄蒎烯                                MI = (M 期细胞数 / 观测细胞数) ×100%ꎮ
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