Page 183 - 《广西植物》2023年第5期
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９ ５ ０ 广 西 植 物 ４３ 卷
１.３.２ 叶表皮条试验 将 Ａ 组表皮条随机分为 ３ １.３.３ 根边缘细胞活性测定 将 Ｂ 组根培养至长
组:第 １ 组ꎬ分别取 ２、４、６、８、１０ μＬ 处理母液ꎬ用 约 ２ ｃｍ 时ꎬ随机截取 ５ 个根尖ꎬ置于 ＥＰ 管中ꎬ向
ＤＭＳＯ 补足体积为 １０ μＬ 后ꎬ加入装有表皮条的 其中加入 １００ μＬ ｄｄＨ Ｏꎬ涡旋振荡 ３０ ｓꎬ取出根尖
２
ＥＰ 管中ꎬ以 １０ μＬ ＭＥＳ 缓冲液为对照ꎻ第 ２ 组ꎬ分 用 ｄｄＨ Ｏ 冲洗 ２ 次ꎬ每次 ５０ μＬꎬ移液枪吹打使细
２
别加入 １０ μＬ 泛 ｃａｓｐａｓｅ 抑制剂 Ｚ￣ＶＡＤ￣ＦＭＫ(１０、 胞分散ꎬ得到根边缘细胞悬液ꎻ分别取处理母液 １、
￣１ ２＋ ￣１ ２、３、４、５ μＬꎬ用 ＤＭＳＯ 补足体积为 ５ μＬ 后ꎬ分别
４０ μｍｏｌ Ｌ )、Ｃａ 通 道 阻 断 剂 ( ０. １ ｍｍｏｌ Ｌ
￣１
ＬａＣｌ )、活 性 氧 清 除 剂 抗 坏 血 酸 ( ０. １ ｍｍｏｌ Ｌ 加入 ２００ μＬ 细胞悬液ꎬ以 ＤＭＳＯ 为溶剂对照组、
３
￣１ ｄｄＨ Ｏ 为阴性对照组ꎬ置于(２５±１)℃ 的培养箱中
ＡｓＡ)和硝酸还原酶抑制剂(０.１ ｍｍｏｌＬ ＮａＮ )
３ ２
处理 ５ ｍｉｎ 后ꎬ加入 ８ μＬ 处理母液和 ２ μＬ ＤＭＳＯꎬ 避光培养 ３０ ｍｉｎꎬ每处理重复 ３ 次ꎻ处理结束后ꎬ
设置阴性对照( ＣＫ 为 ＭＥＳ 缓冲液) 和阳性对照 分别取 １０ μＬ 细胞悬液ꎬ加入 ４ μＬ ＡＯ / ＥＢ 染料ꎬ
(处理母液 ８ μＬ)ꎻ第 ３ 组ꎬ置于 ２５ ℃ 、４ ０００ ｌｘ 的 暗处染色 ２ ~ ３ ｓꎬ荧光显微镜镜检ꎬ统计死细胞和
光照培养箱 ２ ｈ 后ꎬ用 １０ μＬ 的微丝聚合抑制剂细 活细胞的数量ꎬ并计算根边缘细胞死亡率ꎮ 计算
胞松弛素 Ｂ( ＣＢꎬ１０、２０ μｍｏｌＬ )、ＮＡＤＰＨ 氧化 公式如下:
￣１
酶抑制剂二联苯碘(ＤＰＩꎬ１、２ μｍｏｌＬ )和活性氧 死亡率 ＝ (死细胞 / 总细胞计数) ×１００％ꎮ
￣１
￣１ １.４ 数据统计分析
清除剂抗坏血酸(０.１ ｍｍｏｌＬ ) 分别处理 ５ ｍｉｎ
后ꎬ加入 ８ μＬ 处 理 母 液 和 ２ μＬ ＤＭＳＯꎮ 以 不 加 使用 Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１９ 软件进行数据统计
ＣＢ、ＤＰＩ 和 ＡｓＡ 的 ＭＥＳ 缓冲液为 ＣＫ 阴性对照ꎬ以 和作图ꎬ用 ＳＰＳＳ ２０.０ 软件对数据进行 ＡＮＯＶＡ 单
８ μＬ 处理液单独处理为阳性对照ꎮ ３ 组处理混匀 因素方差分析和 Ｔｕｋｅｙ 法进行多重比较分析ꎮ
后均置于 ２５ ℃ 、４ ０００ ｌｘ 光照培养箱处理 ３０ ｍｉｎꎬ
待处理结束后测定气孔开度、细胞核形态、保卫细 ２ 结果与分析
胞活性、胞内 ＲＯＳ、ＮＯ 和 Ｃａ 水平以及 ＴＵＮＥＬ(黄
２＋
素等ꎬ２０１９)等指标ꎮ ２.１ 大叶桉挥发物的化感效应及其遗传毒性
ｑＲＴ￣ＰＣＲ 分析:取第 １ 组叶表皮条ꎬ用液氮充 ２.１.１ 大叶桉挥发物对蚕豆的化感效应 由图 １ 可
分研磨ꎬ按照武汉塞维尔生物科技有限公司的植 知ꎬ大叶桉挥发油、α￣蒎烯和桉油精对蚕豆幼根伸
物总 ＲＮＡ 提取试剂盒操作说明提取蚕豆叶表皮 长具有显著抑制效应( Ｐ<０.０５)ꎬ并表现为时间－
条的总 ＲＮＡꎻ用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５.０ 引物设计软件ꎬ 浓度依赖效应ꎮ 用最大浓度处理 ７２ ｈ 后ꎬ大叶桉
设计蚕豆 ＮＡＤＰＨ 氧化酶基因( Ｒｂｏｈ) 和内参基因 挥发油、α￣蒎烯和桉油精处理组的蚕豆根长比对
(ＥＦ￣１￣ａｌｐｈａ)特异性引物ꎬ序列如下: 照组分别减少了 ８０.６２％、７６.７４％和 ７５.１９％ꎮ
Ｒｂｏｈ Ｆ:５′￣ＧＧＧＴＡＴＴＴＧＣＴＣＴＧＴＧＧＡＴＴＧＧ￣３′ꎻ ２.１.２ 大叶桉挥发物的遗传毒性 在大叶桉挥发
Ｒｂｏｈ Ｒ:５′￣ＣＣＴＧＡＧＣＣＡＡＧＴＡＡＴＧＧＴＧＴＴＴＣ￣３′ꎻ 油、α￣蒎烯和桉油精的作用下ꎬ蚕豆根尖分生区细
ＥＦ￣１￣ａｌｐｈａ Ｆ:５′￣ＡＣＧＡＧＧＣＴＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣ 胞的有丝分裂指数下降(图 ２)ꎮ 在 １ μＬ 处理母液
ＴＣＴＴＣＣ￣３′ꎻ 作用下ꎬ有丝分裂指数升高ꎬ其中 ２４ ｈ 处理组的变
ＥＦ￣１￣ａｌｐｈａ Ｒ:５′￣ＣＣＴＴＧＧＣＡＧＧＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧ 化最为显著ꎮ 当处理母液大于 １ μＬ 时ꎬ与对照组
ＧＡＧＴＴＧ￣３′ꎮ 相比ꎬ随着处理母液浓度增加和处理时间延长ꎬ有
引物均由武汉塞维尔生 物 科 技 有 限 公 司 合 丝分裂指数显著下降( Ｐ < ０.０５)ꎮ 在各处理组 Ｍ
成ꎮ 使用荧光定量 ＰＣＲ 仪( Ｓｔｅｐｏｎｅ ｐｌｕｓꎬＡＢＩ) 进 期(有丝分裂期) 的各时相( 前、中、后、末) 细胞数
行 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 分 析ꎮ 反 应 体 系 为 ２５ μＬꎬ 含 ｑＰＣＲ 目中大部分细胞的细胞周期被阻滞在分裂前期ꎻ
Ｍｉｘ １２.５ μＬ、７.５ μｍｏｌＬ 基因引物 ２.０ μＬ、反转 当挥发油处理母液高于 ４ μＬ 时ꎬ有丝分裂指数趋
￣１
录产物 ２. ５ μＬ、ｄｄＨ Ｏ ８. ０ μＬꎮ ＰＣＲ 扩 增 程 序: 于平稳ꎬ表明该浓度下蚕豆根尖已严重受损ꎮ
２
９５ ℃ １０ ｍｉｎꎬ９５ ℃ １５ ｓꎬ６０ ℃ ６０ ｓꎬ４０ 个循环ꎻ每 各处理组 的 微 核 率 均 显 著 高 于 对 照 组 ( Ｐ <
处理重复 ３ 次ꎬ以 ＭＥＳ 缓冲液为 ＣＫ 对照ꎻ使用 ０.０５)ꎬ呈先升高后降低的趋势( 图 ３)ꎬ在处理母
ＳｔｅｐＯｎｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ２. ３ 软 件 分 析 ＰＣＲ 过 程 的 ＣＴ 液为 ３ μＬ 时微核率达到最大值ꎬ以 ４８ ｈ 处理组的
(ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ)值ꎮ 变化最显著ꎬ其挥发油、α￣蒎烯和桉油精微核率分
