Page 7 - 《广西植物》2023年第7期
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７ 期 向维等: 三七皂苷类自毒物质降解细菌分离及其降解特性 １ １ ７ ５
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果(李 茹 和 陈 鹏ꎬ２０１１ꎻ 李 敏 等ꎬ２０１９ꎻ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ｇＬ ꎮ ＴＳＡ 培养基( ｐＨ ７.０): 胰蛋白胨 １５ ｇ
２０１９)ꎮ 目前ꎬ研究人员已经筛选到了一些能降解 Ｌ 、大豆蛋白胨 ５ ｇＬ 、氯化钠 ５ ｇＬ ꎮ
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自毒物质的细菌ꎬ主要是针对酚酸类物质ꎬ这些微 １.３ 降解菌的富集和驯化
生物主 要 来 源 于 土 壤 等 外 界 环 境ꎬ 如 假 单 胞 菌 将土壤样品中的杂物清理干净ꎬ取不同采样
(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ )、 根 瘤 菌 ( Ｒｈｉｚｏｂｉａ )、 芽 孢 杆 菌 点的土 壤 样 品 ５ ｇꎬ分 别 添 加 到 １００ ｍＬ 含 有 ５０
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( Ｂａｃｉｌｌｕｓ )、 链 霉 菌 ( Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ) 等 ( 李 敏 等ꎬ ｍｇｍＬ 总皂苷的 ＭＳＭ 液体培养基中ꎬ置于 ３０
２０１９)ꎮ 但是ꎬ目前对于总皂苷类物质降解菌株的 ℃ 、１８０ ｒｍｉｎ 的恒温培养振荡器中培养 ７ ｄꎮ 此
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报道却较少ꎮ 因此ꎬ筛选并利用降解菌使土壤中 后ꎬ每 ７ ｄ 取 上 一 次 培 养 液 １０ ｍＬ 转 接 到 新 的
皂苷类自毒物质快速消减ꎬ对后续开展连作土壤 ＭＳＭ 培养液中ꎬ并提高总皂苷的底物浓度至 １００
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生物修复的研究具有重要意义ꎮ ｍｇｍＬ ꎬ于相同条件下培养ꎮ 重复此操作ꎬ并提
本研究以皂苷类自毒物质为筛选靶标ꎬ采用富 高底物浓度(２ 倍法) 直至总皂苷最高浓度达到
集和驯化策略从三七根际土壤中分离降解细菌ꎬ同 ４００ ｍｇｍＬ 为止ꎮ 每个处理均设 ３ 次重复ꎬ以加
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时结合 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因测序分析对活性菌株进行分 入无菌水为空白对照(刁硕等ꎬ２０１７)ꎮ
类鉴定ꎬ并综合利用化学法、色谱法评价分离菌株 １.４ 降解菌的分离及纯化
的降解能力ꎮ 拟探讨:(１) 从连作三七根际土壤筛 取最后一次富集菌液ꎬ将菌液 １０ 倍比稀释ꎬ
选皂苷类自毒物质降解细菌的可行性ꎻ(２) 菌株对 吸取一定量的稀释液分别涂布至 ＬＢ 固体培养基
三醇型和二醇型皂苷降解能力的差异ꎻ(３) 液体培 上ꎬ以无菌水为对照ꎬ置于 ３０ ℃ 的恒温培养箱中
养条件下ꎬ不同因素对降解菌降解能力的影响ꎮ 培养ꎬ观察并记录菌落形状、大小、透明度及颜色
等ꎮ 将同一平板上不同形态的菌落分别接种至含
１ 材料与方法 ４００ ｍｇｍＬ 三七总皂苷的 ＭＳＭ 固体培养基上划
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线培养ꎬ直至长出单菌落ꎮ 继续挑选单菌落划线
１.１ 供试土壤 培养ꎬ重复此步骤ꎬ至平板上所有菌落的外部形态
在广西百色市那坡县三七人工种植基地( Ａꎬ 一致ꎮ 将分离纯化后的菌株分别用甘油超低温和
１０５°５５′５６″ Ｅ、２３°３４′１１″ Ｎ)、广西百色市田林县三 真空冻干 ２ 种保存方法保存ꎬ备用ꎮ
七人工种植基地(Ｂꎬ１０６°３′１″ Ｅ、２４°１１′２８″ Ｎ)、那 １.５ 降解能力初筛
坡县某农 户 家 半 野 生 三 七 地 ( Ｃꎬ１０５° ５４′２９″ Ｅ、 将纯化后的菌种接种于 ＬＢ 培养基中培养 ２４
２３°２１′５１″ Ｎ)、云南文山市三七人工种植基地( Ｄꎬ ｈꎬ用无菌水重悬菌液ꎻ取 ５ ｍＬ 菌液接种到含有
１０３°５０′３３″ Ｅ、２３°５７′３８″ Ｎ) 采集样品ꎮ 从每个采 ２００ ｍｇｍＬ 总皂苷的 １００ ｍＬ ＭＳＭ 液体培养基
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样地随机选取 ５ 个点ꎬ选择 ３ 年生及以上的健康三 中ꎬ在 ３０ ℃ 、１８０ ｒｍｉｎ 条件下培养ꎬ所有处理重
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七ꎬ用铁铲小心地将植株连根挖出ꎬ抖落根周围土 复 ３ 次ꎬ以接种无菌水为对照ꎮ ９６ ｈ 后ꎬ对培养物
壤ꎬ用刷子轻刷根系收集根际土壤ꎮ 离心且收集上清液ꎬ用氯仿萃取上清液ꎬ保留氯仿
１.２ 仪器和试剂 层、挥干ꎬ用乙醇定量溶解后基于香草醛法测定培
Ｅｚｕｐ 柱式细菌基因组 ＤＮＡ 抽提试剂盒购自 养液中总皂苷含量( 丁永丽等ꎬ２０１３)ꎮ 精密配制
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生工生物工程( 上海) 股份有限公司ꎬＢｉｏｌｏｇ ＧｅｎＩＩＩ 分别含 ５０、１００、１５０、２００、２５０ ｍｇｍＬ 浓度的总
鉴定微孔板购自美国 ＢＩＯＬＯＧ 公司ꎮ 紫外分光光 皂苷供试溶液ꎬ以 ＭＳＭ 培养基为校正空白ꎬ测量
度计(ＵＶ１８００ꎬ日本岛津公司)、菌种鉴定仪( ＧＥＮ 总皂苷含量ꎮ 以总皂苷浓度为横坐标ꎬ吸光值为
ＩＩＩꎬ美国 ＢＩＯＬＯＧ 公司)、ＰＣＲ 仪( ｉｍｐｌｉＡｍｐꎬ赛默 纵坐标绘制标准曲线ꎬ计算校正方程和 Ｒ 值ꎮ
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飞世尔科技有限公司)ꎮ １.６ 降解菌 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因序列分析
Ｌｕｒｉａ￣Ｂｅｒｔａｎｉ 培养基( ＬＢꎬｐＨ ７.０): 含胰蛋白 使用基因组 ＤＮＡ 抽提试剂盒提取细菌基因
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胨 １０.０ ｇＬ 、酵母提取物 ５.０ ｇＬ 和 ＮａＣｌ １０.０ 组ꎬ使 用 通 用 引 物 ２７Ｆ 和 １４９２Ｒ 从 基 因 组 扩 增
ｇＬ ꎮ 无 机 盐 离 子 培 养 基 ( ＭＳＭꎬｐＨ ７. ０): 含 １６Ｓ ｒＲＮＡ基因( Ｘｉａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０)ꎮ ＰＣＲ 产物委
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(ＮＨ ) ＳＯ １.０ ｇＬ 、ＫＨ ＰＯ ０.５ ｇＬ 、Ｋ ＨＰＯ 托给上海生工进行测序ꎮ 所得的 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因序
４ ２ ４ ２ ４ ２ ４
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１.５ ｇＬ 、ＮａＣｌ １.０ ｇＬ 和 ＭｇＳＯ ７Ｈ Ｏ ０.１ 列提交给 ＥｚＢｉｏＣｌｏｕｄ 在线鉴定ꎬ并将序列上传至
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