Page 154 - 《广西植物》2023年第9期
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１ ７ ０ ２ 广 西 植 物 ４３ 卷
桃种植产业的发展ꎮ 中华猕猴桃基因组序列的公 突变植株组培苗经过 ４ ℃ 下 １２ ｈ 寒胁迫处理ꎬ对
布使得深入研究红阳猕猴桃耐寒生物学成为可能ꎮ 其进行取样并用锡箔纸包装并标号ꎬ将 ６ 个样品
基于已知基因组序列基础上的转录组测序ꎬ在基因 寄达陕西博瑞德公司进行转录组测序分析ꎮ
的挖掘及表达调控方面具有强大的功能ꎬ也是研究 １.３.１ 测序数据处理 根据实验材料的基因信息
猕猴桃生长发育及优良性状形成过程中相关基因 和参考基因组ꎬ按照过滤标准过滤原始转录组数
科学高效的方法ꎮ 为解决当前红阳猕猴桃抗寒性 据中的低质量序列( 质量≤２０ 的碱基数占整个
差ꎬ及相关抗寒相关机理不清的问题ꎬ本研究拟在 Ｒｅａｄｓ 的 ５０％以上的低质量 Ｒｅａｄｓ)、杂质和接头ꎮ
组织培养过程中的低温环境下筛选出红阳耐寒突 １.３.２ 参考基因组序列对比 将 ＲＮＡ￣ Ｓｅｑ 测序所
变体并进行转录组水平分析ꎬ为选育红心猕猴桃优 得 Ｃｌｅａｎ ｒｅａｄｓ 与其参考基因组序列进行序列对比ꎬ
良种质资源及研究耐寒机理提供了科学依据ꎮ 得到 Ｒｅａｄｓ 定位信息ꎮ 通过对比可以得到测序数据
利用率及测序样品与参考基因组亲缘关系的远近ꎮ
１ 材料与方法 １.３.３ 基因表达量分析及差异表达基因检测 通过
ｂｏｗｔｉｅ２ 工具将获得的 Ｃｌｅａｎ ｒｅａｄｓ 与参考转录组序
１.１ 实验材料 列进行对比ꎬ并统计基因对比率ꎮ 使用 ＲＳＭＥ 分析
本研究采用西南林业大学温室大棚种植的红 统计对比结果ꎬ获得每个样注释到参考转录组序列
阳猕猴桃植株健康叶片为实验材料ꎮ 的 Ｒｅａｄｓ 数目ꎬ并计算其 ＦＰＫＭ 值ꎬ计算 Ｆｒａｇｍｅｎｔ 统
１.２ 实验方法 计转录并通过 ＦＤＲ 检验差异表达基因 Ｐ ｖａｌｕｅ 数
１.２.１ 组织培养体系建立 按照师万源等(２０２１)的 值ꎬ并检验校正 Ｐ ｖａｌｕｅ 阈值ꎮ 差异检验的 ＦＤＲ 值
方法取红阳猕猴桃幼嫩叶片作为外植体ꎬ经流水冲 越小ꎬ其差异倍数越大ꎬ所表达差异越显著ꎮ
洗 ３０ ｍｉｎꎬ于超净工作台内用 ７５％ Ｃ Ｈ ＯＨ 消毒 １.３.４ 差 异 表 达 基 因 的 ＧＯ 功 能 富 集 分 析 ＧＯ
２ ５
２０ ｓꎬ再用 ０.１％ ＨｇＣｌ 溶液消毒 ５ ｍｉｎꎮ 叶片切成约
２ (Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ)富集分析按照国际标准分类分为 ３
￣１ ￣１ 大类ꎬ即生物学过程、细胞组成和分子功能ꎮ 把差
１ ｃｍ × １ ｃｍ 的大小放到 ４.４ ｇＬ ＭＳ ＋ ４.５ ｇＬ
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琼脂 ＋ １５ ｇＬ 蔗糖 ＋ ２.０ ｍｇＬ ＴＤＺ ＋ ０.５ ｇ 异表达基因注释到 ＧＯ 数据库中ꎬ将 ＦＤＲ 值≤０.０５
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Ｌ ＩＢＡ 培养基中培养诱导愈伤组织ꎬ每瓶放置 ３ ~ ４ 的差异表达基因作为显著富集的基因本位条目ꎮ
片切好的叶片ꎮ 待愈伤组织诱导分化不定芽时培 １.３. ５ 差 异 表 达 基 因 ＫＥＧＧ 富 集 分 析 ＫＥＧＧ
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养基更换为 ４.４ ｇＬ ＭＳ ＋ ４.５ ｇＬ 琼脂 ＋ １５ (Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ) 是关于
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ｇＬ 蔗糖 ＋ ０.３ ｍｇＬ ＮＡＡ ＋ ３.０ ｍｇＬ ６￣ＢＡꎮ Ｐａｔｈｗａｙ 的公共基因库ꎬ其全称为京都基因与基因
１.２.２ ＥＭＳ 诱导与筛选体系建立 突变体诱导时将 组数据库ꎬＫＥＧＧ 主要包括 ＫＥＧＧ Ｐａｔｈｗａｙ、ＫＥＧＧ
ＥＭＳ 溶液经 ０.２２ μｍ 的过滤器抽滤灭菌ꎬ过滤灭菌 基因、 ＫＥＧＧ 基 因 组、 ＫＥＧＧ 反 应 过 程 等 分 类ꎮ
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后将 ＥＭＳ 加入高温灭菌后的培养基(４.４ ｇＬ ＭＳ＋ Ｐａｔｈｗａｙ 富集分析是以 ＫＥＧＧ 途径为单位ꎬ将差异
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４.５ ｇＬ 琼脂＋１.５ ｍｇＬ ６￣ＢＡ＋０.１ ｍｇＬ ＮＡＡ＋ 表达基因进行注释分类ꎬ并运用超几何检验ꎬ使用
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１５ ｇＬ 蔗糖) 中ꎬＥＭＳ 培养基配制成 ０.０１ ~ ０.１０ Ｒ 语言进行富集分析及 Ｐ ｖａｌｕｅ 矫正ꎮ
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ｇＬ 诱变浓度ꎬ并以不含 ＥＭＳ 的培养基为对照组ꎮ １.４ 数据处理
每个处理分别接种 ４５ 瓶ꎬ接种后将全部培养瓶放置 生理指标数据采用 Ｅｘｃｅｌ ２００３ 软件进行数据
于光照强度 ２ ０００ ｌｘ、培养温度(２６ ± １) ℃、日照 １５ 比较分析ꎬ差异表达基因表达量使用 ＳＰＳＳ ２２.０ 软
ｈ 的培养室内ꎬ观察并记录统计外植体存活率ꎬ以及 件进行显著性检验(Ｐ<０.０５)ꎮ
筛选出 ５０％半致死剂量(ＬＤ５０)ꎮ 将 ＥＭＳ 诱变的红
阳猕猴桃植株与未经诱变植株放在 ４ ℃冰箱中处理 ２ 结果与分析
１２ ｈꎬ取出后开始观察其生长状况及进行形态鉴定ꎬ
初步筛选出耐寒突变植株ꎮ ２.１ ＥＭＳ 诱导体系
１.３ 转录组测序 ２.１.１ 不同 ＥＭＳ 处理对红阳猕猴桃愈伤组织死亡
设置对照组 Ａ 、Ａ 、Ａ ３ 瓶正常红阳猕猴桃植
１ ２ ３ 率的影晌 红阳猕猴桃叶片经愈伤组织诱导后ꎬ
株组培苗和实验组 Ｂ 、Ｂ 、Ｂ ３ 瓶红阳猕猴桃耐寒 对其进行不同浓度 １０ 个梯度 ＥＭＳ 培养ꎬ并设置未
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