Page 7 - 《广西植物》2024年第10期
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１０ 期              王新叶等: 糯高粱叶中 ＩＡＡ 产生菌的分离筛选及其促植物生长作用                                       １ ８ ０ ９

                 ＩＡＡ 属于植物生长素家族中的吲哚衍生物ꎬ是                        １.２.３ 菌株的分子生物学鉴定  用改良月桂酸钠法
            调节 植 物 各 种 发 育 和 生 理 过 程 的 主 要 激 素                 提取菌株的基因组 ＤＮＡꎬ用细菌通用引物 ２７Ｆ(５′￣
            (Ｎｕｔａｒａｔａｔ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５)ꎬ能够刺激细胞分裂、细胞               ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ￣３′)和 １４９２Ｒ(５′￣ＧＧＴ
            伸长、细胞分化、光和重力响应、调节叶片掉落和                             ＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴ￣３′)扩增菌株的 １６Ｓ ｒＤＮＡ 片
            果实成熟等( Ｔｅａｌｅ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００６)ꎮ 因此ꎬ植物内生                段ꎬ将 ＰＣＲ 产物送至生工生物工程( 上海) 股份有
            菌的 ＩＡＡ 产生能力被认为是促进植物生长的关键                           限公司进行测序ꎬ将测序得到的 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列信
            指标ꎮ 本研究以酿酒用的糯高粱红缨子品系为材                             息与 ＮＣＢＩ 的 ＧｅｎＢａｎｋ 数据库进行比对ꎬ下载与菌

            料ꎬ采用 ＬＢ 培养基分离叶内生菌ꎬ利用 Ｓａｌｋｏｗｓｋｉ                     株 １６Ｓ ｒＤＮＡ 同源性较高模式菌株的 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序
            试剂检测菌株的 ＩＡＡ 产生能力ꎬ结合 １６Ｓ ｒＤＮＡ 测                     列ꎬ利用 ＭＥＧＡ １１ 软件中 ＣｌｕｓｔａｌＷ １.６ 程序进行序
            序分析对菌株进行分子生物学鉴定ꎬ并综合种子                              列比对ꎬ使用 ＭｏｄｅｌＴｅｓｔ ３.７ 结合 ＰＡＵＰ∗４.０ｖ１０ｂ 用
            萌发实验和糯高粱盆栽实验评价菌株对糯高粱的                              于计算贝叶斯推断树最优构建模型ꎬ模型选取采用
            促生长能力ꎬ从而获得对糯高粱生长有促进作用                              Ａｋａｉｋｅ 信息准则(Ｐｏｓａｄａ ＆ Ｃｒａｎｄａｌｌꎬ １９９８)ꎮ 使用
            的微生物菌株ꎬ并对微生物菌株的促生长机制进                              ＭｒＢａｙｅｓ ３.１.２ 软件构建贝叶斯推断树ꎬ建树过程采
            行初步探究ꎬ以期为进一步开发促糯高粱生长菌                              用 Ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｓ￣ｃｏｕｐｌｅｄ Ｍａｒｋｏｖ ｃｈａｉｎ Ｍｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏ
            剂提供种质资源ꎮ                                           (ＭＣＭＣＭＣ)算法ꎬ设置 １ 条冷链 ３ 条热链抽取随机
                                                               树ꎬ并运行运算 ２ 次ꎬ共设置 ２ ０００ ０００ 代ꎬ每１ ０００
            １  材料与方法                                           代取 １ 次样ꎬ运算收敛(平均分裂标准差<０.０１) 后
                                                               得到 ２ ０００ 个树的后验分布ꎮ 剔除前 ２５％(共 ５００
            １.１ 材料                                             个)分布不稳定的样本树ꎬ留下后 ７５％ ( 共 １ ５００
                 供试材料为贵州省茅台镇酱香型白酒酿造用                           个)样本树用于获得 ５０％最大共有树ꎬ即最终的 １６Ｓ
            糯高粱ꎬ糯高粱品种为‘红缨子’ꎬ来自仁怀市丰源                            ｒＤＮＡ 系统进化树( Ｈｕｅｌｓｅｎｂｅｃｋ ＆ Ｒｏｎｑｕｉｓｔꎬ ２００１ꎻ
            有机高粱育种中心ꎮ                                          Ｒｏｎｑｕｉｓｔ ＆ Ｈｕｅｌｓｅｎｂｅｃｋꎬ ２００３)ꎮ
            １.２ 方法                                             １.２.４ 菌悬液制备  从 ＬＢ 平板上挑取单菌落ꎬ接
            １.２.１ 内生菌的分离纯化  称取 １０ ｇ 糯高粱幼苗                      种在 ＬＢ 液体培养基中ꎬ３０ ℃ １５０ ｒｍｉｎ 条件下
                                                                                                     ￣１
            的叶片ꎬ先用无菌剪刀剪成小块后进行表面消毒                              培养 ３ ｄ 后ꎬ５ ０００ ｒｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎ 收集菌体ꎬ
                                                                                      ￣１
            (７０％乙醇 ２ ｍｉｎꎬ５％次氯酸钠 ５ ｍｉｎꎬ７０％ 乙醇 ２                 用无菌水洗涤 ３ 次后ꎬ加入无菌水ꎬ制备菌悬液ꎬ
            ｍｉｎꎬ无菌水冲洗 ３ 次)ꎬ再将叶片剪碎ꎬ转移到 ９０                       调整菌悬液的终浓度 ＯＤ              为 ０.５ ~ ０.６ꎬ备用ꎮ
                                                                                     ６００ ｎｍ
            ｍＬ 无菌水中ꎬ旋涡振荡 ３０ ｍｉｎꎬ作为菌悬液母液ꎮ                       １.２.５ 种子预处理  挑选颗粒饱满、大小均匀的糯
            将菌悬液用无菌水逐级稀释到 １０ 、１０ 和 １０ 三                        高粱种子ꎬ加入 ７０％乙醇ꎬ处理 ２ ｍｉｎꎻ倒掉乙醇ꎬ
                                            ￣１
                                                       ￣３
                                                 ￣２
            个浓度梯度ꎬ分别从各个浓度梯度菌悬液中吸取                              加入 ５％的次氯酸钠ꎬ处理 ５ ｍｉｎꎻ倒掉次氯酸钠ꎬ
            １００ μＬ 到 ＬＢ 固体平板上ꎬ涂布均匀ꎮ 在 ３０ ℃ 培                   加入 ７０％的乙醇ꎬ处理 ２ ｍｉｎꎻ倒掉 ７０％乙醇ꎬ用无
            养箱中倒置培养 ７２ ｈꎮ 挑取 ＬＢ 平板上长出的单                        菌水冲洗 ３ ~ ５ 次ꎮ
            菌落ꎬ用分区划线法对菌株进行纯化ꎬ将纯化好的                             １.２.６ 菌悬液浸种  量取 １００ ｍＬ 菌悬液ꎬ将糯高

            菌株用终浓度为 ３０％的甘油进行保藏ꎮ                                粱种子浸泡在菌悬液中ꎬ用锡纸包裹避光ꎬ室温放
            １.２.２ ＩＡＡ 产生能力的测定  将菌株接种于 Ｒ２Ａ                      置 ６ ｈꎬ倒掉菌悬液ꎬ用无菌水将糯高粱种子清洗
                                           ￣１                  ３ ~ ５ 次ꎬ用无菌的镊子将糯高粱种子平铺在水琼
            液体培养基中ꎬ３０ ℃ １５０ ｒｍｉｎ 条件下培养 ４ ｄ
            后ꎬ测定菌悬液在 λ ＝ ６００ ｎｍ 处的吸光值ꎮ 将培养                     脂(１.４％琼脂) 平板上ꎬ将平板倒置于 ２８ ℃ 培养
                                                  ￣１           箱中培养ꎮ 对照组用等量蒸馏水处理ꎬ每个处理
            好的菌悬液置于离心机中ꎬ５ ０００ ｒｍｉｎ 离心 １０
            ｍｉｎꎮ 取上清液 １０ ｍＬꎬ加入等体积的 Ｓａｌｋｏｗｓｋｉ 比                 选用 １００ 颗糯高粱种子ꎬ对照组和实验组分别设

            色液ꎬ避光静置 ３０ ｍｉｎ 后ꎬ测定混合液在 λ ＝ ５３０                    置 ３ 个重复ꎮ
            ｎｍ 处的吸光值ꎮ 通过 ＩＡＡ 浓度标准曲线计算 ＩＡＡ                      １.２.７ 结果统计  分别于第 ３ 天和第 ７ 天统计种子
            的产生量ꎬ并计算菌体浓度 ＯＤ                 为 １ 时ꎬ菌株单          发 芽 数 量ꎬ 计 算 发 芽 势 和 发 芽 率 ( 郑 庆 钟 等ꎬ
                                         ６００ ｎｍ
            位浓度 ＩＡＡ 的产生量(何建清等ꎬ ２０１９)ꎮ                          ２０１６)ꎮ 计算公式:
   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12