Page 100 - 《广西植物》2024年第12期

２ ２ ５ ８ 广 西 植 物 ４４ 卷
因检测 ３ 组平行ꎮ 实时荧光定量 ＰＣＲ 设定程序如 ＺｍＳＰＹ 蛋白质的二级结构预测结果( 图 ３: Ａ) 显
下:９５ ℃ ５ ｍｉｎꎻ变性 ９５ ℃ ２０ ｓꎬ退火 ５０ ℃ １５ ｓꎬ 示ꎬＺｍＳＰＹ 蛋白由 ５８.６２％ 的 α￣螺旋、７.２４％ 的延
延伸 ７２ ℃ １５ ｓꎬ以上循环 ４５ 次ꎻ７２ ℃ 继续延伸 １０ 伸链、５.９３％的 β￣转角和 ２８.２１％的无规卷曲共同
ｍｉｎꎮ 待程序运行完成后ꎬ将目标基因和内参基因 组成ꎮ ＺｍＳＰＹ 蛋白质的三级结构预测结果( 图 ３:
－△△Ｃｔ ꎬ计算得出基因
扩增所得的 Ｃｔ 值ꎬ代入公式 ２ Ｂ)显示ꎬα￣螺旋是 ＺｍＳＰＹ 蛋白的主要构成元件ꎮ
的相对表达量ꎬ并进行分析ꎮ Ｅｘｐａｓｙ￣ＰｒｏＳｃａｌｅ 预 测 结 果 ( 图 ４: Ａ) 显 示ꎬ
１.２.５ 数据分析 所有指标的检测至少重复进行 ３ ＺｍＳＰＹ 蛋白 属 于 亲 水 性 蛋 白ꎬ 在 氨 基 酸 序 列 第
次ꎬ实验 结 果 以 平 均 值 ± 标 准 差 ( ｘ ± ｓ) 表 示ꎬ 并 ３３４ 个位点处ꎬ亲水性最高ꎻ在氨基酸序列第 １４５
作图ꎮ 个位点处ꎬ疏水性最高ꎮ ＴＭＨＭＭ ２.０ Ｓｅｒｖｅｒ 预测
结 果 显 示ꎬ ＺｍＳＰＹ 蛋 白 不 存 在 跨 膜 结 构 域ꎮ
２ 结果与分析 ＹｉｎＯＹａｎｇ １. ２ Ｓｅｒｖｅｒ 预 测 结 果 ( 图 ４: Ｂ) 显 示ꎬ
ＺｍＳＰＹ 蛋白共有 ３３ 个糖基化位点ꎮ Ｗｏｌｆ Ｐｓｏｒｔ 预
２.１ ＺｍＳＰＹ 保守结构域与氨基酸序列比对分析 测 ＺｍＳＰＹ 蛋白的亚细胞定位结果显示ꎬ该蛋白可
通 过 ＮＣＢＩ 网 站 的 Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｓｅａｒｃｈ 能定位于细胞核、细胞质中ꎬ并且定位于细胞核的
Ｓｅｒｖｉｃｅ (ＣＤ Ｓｅａｒｃｈ)模块对 ＺｍＳＰＹ 蛋白进行结构 可能性更大ꎮ
域分析ꎬ由 图 １: Ａ 可 知ꎬ ＺｍＳＰＹ 归 属 于 ＴＰＲ 和 ２.４ ＺｍＳＰＹ 基因的克隆和亚细胞定位研究

ＳＰＹ 超家族ꎬ主要由 ＴＰＲ( ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔｓ) 蛋白质的功能、代谢以及相互作用都与其亚细
结构域以及 Ｃ 端的催化结构域( ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎ) 胞定位密切相关ꎬ成熟的蛋白质只有运输至特定的
构成ꎮ 之后ꎬ利用 ＮＣＢＩ 数据库检索获得拟南芥 亚细胞结构或区域才能发挥正确的生物学功能
(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａꎬ Ａｔ)、 高 粱 ( Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒꎬ (Ｗａｎｇ ＆ Ｂａｌｉｎｔ￣Ｋｕｒｔｉꎬ ２０１５)ꎮ Ｗｏｌｆ Ｐｓｏｒｔ 预测结果
Ｓｂ)、 水 稻 ( Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａꎬ Ｏｓ )、 小 麦 ( Ｔｒｉｔｉｃｕｍ 显示ꎬＺｍＳＰＹ 蛋白定位于细胞核的可能性更大ꎮ 为
ａｅｓｔｉｖｕｍꎬ Ｔａ) 等植物的 ＳＰＹ 蛋白质序列ꎬ并进行 了验证此结果ꎬ通过 ＧＦＰ 融合蛋白表达法来确定
多序列比对分析ꎮ 由图 １: Ｂ 可知ꎬ不 同 物 种 中 ＺｍＳＰＹ 蛋白的亚细胞定位ꎮ 通过克隆获得 ＺｍＳＰＹ
ＳＰＹ 蛋白高度保守ꎬ不同物种间的序列差异主要 基因编码区全长片段( 图 ５: Ａ)ꎬ大小为２ ７３６ ｂｐꎮ
集中于蛋白结构的 Ｃ 末端附近ꎮ 连接、转化ꎬ挑取单菌落验证及提质粒酶切验证ꎬ结
２.２ ＺｍＳＰＹ 蛋白质进化树分析 果显示 ＰＣＲ 扩增片段、酶切片段的长度与目的片段
为了探究 ＳＰＹ 在不同物种之间的亲缘关系及 大小一致(图 ５: Ｂ、Ｃ)ꎬ表明成功构建了由农杆菌
玉米 ＺｍＳＰＹ 的潜在生物学功能ꎬ使用 ＭＥＧＡ１１.０ 软 (ＧＶ３１０３) 介 导 的 ｐＢＩＧＤ￣ＺｍＳＰＹ￣ＧＦＰ 表 达 载 体ꎮ

件构建关于 ＳＰＹ 蛋白的系统进化树ꎮ 由图 ２ 可知ꎬ 通过农杆菌转化使其在烟草表皮细胞中瞬时表达ꎬ
８ 个 物 种 被 分 为 两 大 类ꎬ 玉 米、 高 粱、 柳 枝 稷 结果(图 ６)显示对照组(ｐＢＩＧＤ￣ＧＦＰ)胞内呈现分散
(Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ)、小麦、水稻、拟南芥为一组ꎻ狗 非特异性的荧光信号ꎬ实验组(ｐＢＩＧＤ￣ＺｍＳＰＹ￣ＧＦＰ)
尾草 ( Ｓｅｔａｒｉａ ｖｉｒｉｄｉｓ )、 小 米 ( Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ ｖａｒ. 仅在细胞核上观察到特异性的荧光信号ꎬ与细胞核
ｇｅｒｍａｎｉｃａ)为一组ꎮ 其中ꎬ玉米与同为禾本科植物 经 ＤＡＰＩ 染色后呈现的蓝色荧光信号重叠ꎬ 表明
的高粱属同一支ꎬ说明氨基酸序列一致性最高ꎬ亲 ＺｍＳＰＹ 蛋白定位于细胞核中ꎮ
缘关系最近ꎻ其次玉米与禾本科植物柳枝稷进化关 ２.５ 外源激素处理对 ＺｍＳＰＹ 基因表达量的影响
系密切ꎮ 为探究 ＺｍＳＰＹ 可能参与的生物学过程ꎬ我们
２.３ ＺｍＳＰＹ 蛋白质生物信息学分析 采用不同外源激素处理玉米根系ꎬ通过 ＲＴ￣ｑＰＣＲ
Ｅｘｐａｓｙ￣ＰｒｏｔＰａｒａｍ 分析结果显示ꎬＺｍＳＰＹ 共由 检测 ＺｍＳＰＹ 表达 量 的 变 化ꎬ结 果 ( 图 ７) 显 示 在

９１１ 个氨基酸组成ꎬ分子式为Ｃ Ｈ Ｎ Ｏ Ｓ ꎬ相 受到 不 同 外 源 激 素 ( ＧＡ、 ＩＡＡ、６ＢＡ、 ＡＢＡ) 处 理
４４７６ ７０４０ １２０４ １３５１ ５４
对分子质量约为 １０１.０７ ｋＤꎬ理论等电点为 ５.６２ꎬ 后ꎬＺｍＳＰＹ 表达水平随处理时间的变化表现出不
正负电荷残基总数分别为 １１１ 和 ９２ꎬ不稳定系数 同的变化趋势ꎮ 在 ＧＡ 实验组的处理下ꎬＺｍＳＰＹ
为 ３９.４５( <４０)ꎬ脂溶性指数为 ８７.８５ꎬ总平均亲水 表达量始终表现为下调趋势ꎬ并且下调趋势随处
性为－０.２０ꎮ 分析蛋白质的二级、三级结构ꎬ可为 理时间增长逐渐减弱ꎮ ＩＡＡ、６ＢＡ 实验组变化趋
蛋白功能研究提供基础支撑( 耿柳婷等ꎬ２０２３)ꎮ 势一致ꎬＺｍＳＰＹ 表达量整体呈现出随处理时间的