Page 99 - 《广西植物》2024年第12期
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１２ 期 李博文等: 玉米岩藻糖基转移酶基因 ＳＰＩＮＤＬＹ 的克隆及表达分析 ２ ２ ５ ７
于大连 工 业 大 学 生 物 工 程 学 院 温 室ꎻ 大 肠 杆 菌 的 ＲＮＡꎬ通过 Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｍ￣ＭＬＶ 反转录
( Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ) ＸＬ￣１０ Ｇｏｌｄ 以 及 根 瘤 农 杆 菌 酶将其反转录为 ｃＤＮＡꎮ 以此为模板使用高保真
(Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ) ＧＶ３１０１ 由本实验室保 酶 ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ 和特异性引物
藏ꎻ定位载体 ｐＢＩＧＤ￣ＧＦＰ 为本实验室构建保藏ꎻ植 扩增 ＺｍＳＰＹ 基因编码区全长片段ꎬ通过 １％ 的琼
物 ＲＮＡ 提取试剂 ＴＲＩｚｏｌ、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ 购自天根生 脂糖凝胶检测 ＰＣＲ 产物ꎮ
化科技( 北京) 有 限 公 司ꎻ２ × ＴｒａｎｓＳｔａｒｔ Ｔｏｐ Ｇｒｅｅｎ 将目 的 片 段 胶 块 切 下ꎬ 并 回 收 纯 化ꎬ 使 用
ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ 购自北京全式金生物技术有限公 ＢａｍＨⅠ和 ＫｐｎⅠ两种内切酶同时酶切纯化后的
司ꎻＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、 Ｍ￣ＭＬＶ 反 转 ＰＣＲ 产物与亚细胞定位所需的 ｐＢＩＧＤ￣ＧＦＰ 载体ꎬ
录酶、Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、限制性核酸内切酶、 通过 Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶将 ＺｍＳＰＹ 片段与 ｐＢＩＧＤ￣ＧＦＰ
Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶、琼脂糖凝胶、ＤＮＡ 回收试剂盒购 载体按照 ３ ∶ １ 的比例于 １６ ℃ 下过夜连接ꎬ连接
自宝生物工程( 大 连) 有 限 公 司ꎻＧＡ、ＡＢＡ、ＩＡＡ、 完成后通过热激法转入大肠杆菌感受态细胞ꎬ并
６ＢＡ 购自北京索莱宝科技有限公司ꎻ所需引物均 将菌体涂布至 ＬＢ￣Ｋａｎ 抗性的平板上ꎬ挑取生长状
由北京六合华大基因科技有限公司合成(表 １)ꎮ 态较好的单菌落于 ＬＢ￣Ｋａｎ 液体培养基中培养约 ４
ｈꎬ待菌液浑浊后ꎬ以此为模板进行菌落 ＰＣＲ 鉴定ꎬ
表 １ 本研究所用引物 选择阳 性 菌 液 扩 大 培 养ꎬ 提 取 重 组 质 粒 ｐＢＩＧＤ￣
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ＺｍＳＰＹ￣ＧＦＰꎬ并进行酶切鉴定ꎬ最后送至北京六合
引物名称 引物序列 (５′￣ ３′) 华大基因科技有限公司进行全长测序ꎮ
１.２.３ 农杆菌转化和烟草侵染 参照 ＣａＣｌ 法制备
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′￣ ３′)
２
ＺｍＵＢＱ￣ｑＰＣＲ￣Ｆ ＧＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＴＡＣＡＡＧＧ
根瘤农杆菌 ＧＶ３１０１ 感受态细胞ꎬ将 ｐＢＩＧＤ￣ＧＦＰ
ＺｍＵＢＱ￣ｑＰＣＲ￣Ｒ ＧＣＡＧＴＡＧＴＧＧＣＧＧＴＣＧＡＡＧＴＧＧ
(对照质粒) 与 ｐＢＩＧＤ￣ＺｍＳＰＹ￣ＧＦＰ 质粒分别转入
ＺｍＳＰＹ￣ｑＰＣＲ￣Ｆ５７０ ＣＧＣＡＧＡＡＣＣＴＡＣＣＡＡＧＡＣＡＧ
感受态细胞ꎬ经验证正确后保藏菌种备用ꎮ 另取
ＺｍＳＰＹ￣ｑＰＣＲ￣Ｒ６９１ ＴＴＣＡＡＣＣＡＡＧＴＧＡＣＣＣＴＣＡＴＣ
￣１
２００ μＬ 菌液接种于 ５０ ｍＬ 含 Ｋａｎ(５０ ｍｇｍＬ )、
ＺｍＳＰＹ￣Ｆ２５４ ＧＧＧＴＣＴＡＣＴＧＧＡＧＴＧＣＧＴＴ
Ｇｅｎ(４０ ｍｇｍＬ )和 Ｒｉｆ(２０ ｍｇｍＬ )ＬＢ 液体培
￣１
￣１
ＺｍＳＰＹ￣Ｒ３０８８ ＧＧＡＧＣＧＴＧＡＣＡＣＣＧＴＴＣＴＴ
￣１
ＺｍＳＰＹ￣Ｆ￣ＢａｍＨＩ ＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＧＧＡＴ 养基中ꎬ并加入 １０ ｍｍｏｌＬ ＭＥＳ 和 ２０ ｍｍｏｌＬ ￣１
ＺｍＳＰＹ￣Ｒ￣ＫｐｎＩ ＧＣＧＧＴＡＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＴＧＣＴＧＴＧＡＣＣＡ
乙酰丁香酮ꎬ在 ２８ ℃ 和 １８０ ｒｍｉｎ 条件下扩大培
￣１
养至 ＯＤ 在 ０.６ 左右ꎬ将菌体重悬于侵染缓冲液
６００
１.２ 方法 (５ ｇＬ 葡萄糖、５０ ｍｍｏｌＬ ＭＥＳ、２ ｍｍｏｌＬ ￣１
￣１
￣１
￣１
１.２.１ ＺｍＳＰＹ 生物信息学分析 使用 ＤＴＵ Ｈｅａｌｔｈ Ｎａ ＰＯ １２Ｈ Ｏꎬ１００ μｍｏｌＬ ＡＣＥ) 中ꎬ调菌液
３
４
２
Ｔｅｃｈ 网站中的 ＴＭＨＭＭ、ＳｉｇｎａｌＰ、ＹｉｎＯＹａｎｇ￣１.２ 功 ＯＤ ６００ 在 １.２ 左右ꎬ２８ ℃ 孵育 ３ ｈꎬ用注射器将侵染
能来预测蛋白质结构和功能、跨膜结构域、信号 液注射至本生烟草叶片中ꎬ避光培养 ２ ~ ３ ｄꎬ通过
肽、糖基化位点等ꎻ使用 ＳＯＰＭＡ 网站预测蛋白质 激光 共 聚 焦 显 微 镜 观 察 烟 草 表 皮 细 胞ꎬ 判 断
的二级结构ꎻ使用 Ｐｈｙｒｅ２ 在线网站预测蛋白质的 ＺｍＳＰＹ 蛋白的定位情况ꎮ
三级结构ꎻ使用 Ｅｘｐａｓｙ￣ＰｒｏＳｃａｌｅ 网站对蛋白质进 １.２.４ 实 时 荧 光 定 量 ＰＣＲ 表 达 分 析 通 过 ＲＴ￣
行亲疏水性预测分析ꎻ使用 ＤＮＡＭＡＮ ８.０ 软件对 ｑＰＣＲ 检测 ＺｍＳＰＹ 表达量的变化ꎬ从而探究其对
蛋白质序列进行多序列比对ꎻ使用 ＭＥＧＡ １１.０ 软 不同激素处理的响应ꎮ 分别于培养液中施加 １００
￣１
件的 ＣｌｕｓｔａｌＷ 算法进行序列比对ꎬ并以 Ｍａｘｉｍｕｍ￣ μｍｏｌＬ 的赤霉素( ＧＡ)、吲哚乙酸( ＩＡＡ)、６￣氨
Ｌｉｋｅｌｙｈｏｏｄ 法构建多种植物间的系统进化树ꎻ使用 苄基嘌呤(６ＢＡ)、脱落酸(ＡＢＡ)ꎬ处理玉米 Ｂ３７ 根
Ｗｏｌｆ Ｐｓｏｒｔ 网站进行亚细胞定位的预测ꎮ 系 ３、６、１２ ｈꎮ 提取总 ＲＮＡꎬ进行反转录ꎬ并稀释
１.２.２ ＺｍＳＰＹ 基因的克隆和亚细胞定位载体的构 ｃＤＮＡ 浓度至 １００ ｎｇｕＬ 左右ꎬ以此为模板ꎬ以
￣１
建 从 ＮＣＢＩ 数据库中获得玉米 ＺｍＳＰＹ 的核苷酸 ＺｍＵＢＱ 为内参基因ꎬ使用实时荧光定量 ＰＣＲ 检测
ＦＡＳＴＡ 序列ꎬ使用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５.０ 软件设计目 ＺｍＳＰＹ 基 因 的 表 达 量ꎮ 反 应 体 系 ( ２０ μＬ ):
的基因克隆所需引物( 表 １)ꎬ送至北京六合华大 ＴｒａｎｓＳｔａｒｔ Ｔｏｐ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ Ｓｕｐｅｒ Ｍｉｘ １０ μＬꎬＰｒｉｍｅｒ
基因科技有限公司合成ꎮ 利用 ＴＲＩｚｏｌ 法提取玉米 Ｆ ０.４ μＬꎬＰｒｉｍｅｒ Ｒ ０.４ μＬꎬｃＤＮＡ ２ μＬꎬｄｄＨ Ｏ ７.２
２
Ｂ７３ 根系的总 ＲＮＡꎬ选取完整性较好和纯度较高 μＬꎮ 按照反应体系于冰上加样至 ９６ 孔板ꎬ每个基
