Page 183 - 《广西植物》2024年第2期
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2 期 易航等: 小黄花茶内生真菌的多样性分析及抑菌活性初筛 3 8 5
1.2.2.2 分子生物学鉴定 内生真菌 DNA 用真菌 Margalefs 丰富度指数( M):反映群落中物种
基因组 DNA 快速抽提试剂盒进行提取ꎬ于-20 ℃ 的丰富度ꎮ
保存ꎮ 采用通用引物 ITS1 (5′ ̄TCCGTAGGTGAAC 1
M = S- ꎮ
CTGCGC ̄3′)和 ITS4(5′ ̄TCCTCCGCTTATTGATAT log N
2
GC ̄3′)对提取的 DNA 进行 PCR 扩增ꎬ将扩增后的 Pielous 均匀度指数( E):反映物种在群落中
PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳ꎬ条带明亮清晰的 分布的均匀程度ꎮ
产物送至生工生物工程(上海) 股份有限公司进行 H′
E = ꎮ
测序ꎮ lnS
1.2.3 小黄花茶内生真菌的系统进化分析 测序 以上式中:N 表示不同季节或部位内生真菌 i
i
后的内 生 真 菌 ITS 序 列 在 NCBI 数 据 库 中 进 行 的数量ꎻN 为菌株总数ꎻS 为物种数ꎮ
BLAST(https: / / blast.ncbi.nlm.nih.gov / Blast.cgi) 比 1.2.5 小黄花茶内生真菌抑菌作用 采用平板对
峙培养法测定小黄花茶内生真菌的抑菌活性ꎬ用
对分析ꎬ在 MEGA 11 软件中使用邻接法( neighbor ̄
joiningꎬNJ) 构建系统发育树ꎬ重复计算 1 000 次ꎬ 直径为 6 mm 的打孔器将 35 株供试内生真菌和 8
确定真菌的分类地位(Kumar et al.ꎬ 2016)ꎮ 株病原菌菌株打菌饼ꎬ再将 8 株病原菌菌饼与 35
1.2.4 小黄花茶内生真菌的多样性分析 分别统 株内生真菌菌饼一一对应ꎬ接种至同一 PDA 培养
基的对称位置ꎬ每个处理重复 3 次ꎬ以单独接种病
计小黄花茶内生真菌的定殖率( colonization rateꎬ
CR)、 分 离 率 ( isolation rateꎬ IR )、 分 离 频 率 原菌的 PDA 培养基作为对照ꎬ28 ℃ 暗培养 7 dꎮ
之后用十字交叉法测量病原菌对峙培养的趋向半
( isolation frequencyꎬ IF)、 辛 普 森 指 数 ( Simpsons
diversityꎬ D)、 香 农 - 维 纳 指 数 ( Shannon ̄Weiner 径(r)和单独培养的半径( R)ꎬ计算抑菌率并筛选
diversity indexꎬ H′)、 Pielous 均 匀 度 指 数 ( Pielous 出具有抑菌性的内生真菌ꎮ
evenness indexꎬ E )、 Margalefs 丰 富 度 指 数 R - r
抑菌率 = × 100%ꎮ
(Margalefs richness indexꎬM)ꎬ并基于小黄花茶内 R
生真菌的种类组成ꎬ使用 SPSS 24.0 软件对不同季 分级标 准:抑 菌 率 > 75% 为 强ꎬ50% ~ 75% 为
节和部位的内生真菌进行聚类分析ꎮ 通过以上数 中ꎬ10% ~ 50%为低ꎬ<10%为无ꎮ
据分析小黄花茶内生真菌的多样性、优势种群、分
布的均匀程度、丰富度ꎬ以及不同季节和部位间的 2 结果与分析
相似水平ꎮ
定殖率(CR):长真菌的组织块数量与分离的 2.1 小黄花茶内生真菌的分离
从小黄花茶 324 份组织块中分离得到内生真菌
组织块总数的比值ꎬ反映植物受真菌浸染的程度ꎮ
分离率( IR):某一类菌株的数量与分离的组 261 株ꎬ由表 1 可知ꎬ小黄花茶内生真菌的总定殖率
织块总数的比值ꎬ用于度量组织中真菌的丰度以 和总分离率分别为 71.30%和 80.55%ꎮ 从定殖率来
看ꎬ不同部位内生真菌定殖率不同ꎬ最高的部位为
及组织块受浸染的频率ꎮ
分离频率( IF):某一类菌株的数量与分离得 茎 ( 88. 89%)ꎬ 其 次 为 叶 ( 81. 48%)ꎬ 根 最 低
到的菌株总数的比值ꎬ反映不同种类内生真菌的 (43.52%)ꎻ 不 同 季 节 定 殖 率 也 不 同ꎬ 冬 季 最 高
优势程度ꎮ (75. 31%)ꎬ 秋 季 第 二 ( 72. 84%)ꎬ 其 次 为 春 季
辛普森指数(D):反映群落中物种的优势度或 (69.14%)ꎬ夏季最低(67.90%)ꎮ 分离率从高到低
多样性ꎮ 依次为茎(94.44%) >叶(90.74%) >根(56.48%)ꎬ冬
S N i (88.89%)>秋(83.95%) >春(76.54%) >夏(72.83%)ꎮ
2
D = 1-∑P ꎬP = ꎮ
i
i
i = 1 N 分离频率茎最高ꎬ占 39.08%ꎻ叶其次ꎬ占 37.55%ꎻ根最
香农 - 维 纳 指 数 ( H′): 反 映 群 落 种 类 的 多 低ꎬ占 23.37%ꎮ 按季节从高到低依次为冬(27.59%)>
样性ꎮ 秋(26.05%)>春(23.75%)>夏(22.61%)ꎮ
S N i 2.2 小黄花茶内生真菌的种群组成
H′ = -∑P ×ln P ꎬP = ꎮ
i
i
i
i = 1 N 将提取出的真菌基因组 DNA 以 ITS1 和 ITS4