Page 183 - 《广西植物》2024年第2期
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2 期                   易航等: 小黄花茶内生真菌的多样性分析及抑菌活性初筛                                            3 8 5

            1.2.2.2 分子生物学鉴定  内生真菌 DNA 用真菌                          Margalefs 丰富度指数( M):反映群落中物种
            基因组 DNA 快速抽提试剂盒进行提取ꎬ于-20 ℃                         的丰富度ꎮ
            保存ꎮ 采用通用引物 ITS1 (5′ ̄TCCGTAGGTGAAC                              1
                                                                   M = S-    ꎮ
            CTGCGC ̄3′)和 ITS4(5′ ̄TCCTCCGCTTATTGATAT                       log N
                                                                           2
            GC ̄3′)对提取的 DNA 进行 PCR 扩增ꎬ将扩增后的                         Pielous 均匀度指数( E):反映物种在群落中
            PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳ꎬ条带明亮清晰的                            分布的均匀程度ꎮ
            产物送至生工生物工程(上海) 股份有限公司进行                                   H′
                                                                   E =   ꎮ
            测序ꎮ                                                       lnS
            1.2.3 小黄花茶内生真菌的系统进化分析  测序                              以上式中:N 表示不同季节或部位内生真菌 i
                                                                              i
            后的内 生 真 菌 ITS 序 列 在 NCBI 数 据 库 中 进 行               的数量ꎻN 为菌株总数ꎻS 为物种数ꎮ
            BLAST(https: / / blast.ncbi.nlm.nih.gov / Blast.cgi) 比  1.2.5 小黄花茶内生真菌抑菌作用  采用平板对
                                                               峙培养法测定小黄花茶内生真菌的抑菌活性ꎬ用
            对分析ꎬ在 MEGA 11 软件中使用邻接法( neighbor ̄
            joiningꎬNJ) 构建系统发育树ꎬ重复计算 1 000 次ꎬ                  直径为 6 mm 的打孔器将 35 株供试内生真菌和 8
            确定真菌的分类地位(Kumar et al.ꎬ 2016)ꎮ                     株病原菌菌株打菌饼ꎬ再将 8 株病原菌菌饼与 35
            1.2.4 小黄花茶内生真菌的多样性分析  分别统                          株内生真菌菌饼一一对应ꎬ接种至同一 PDA 培养
                                                               基的对称位置ꎬ每个处理重复 3 次ꎬ以单独接种病
            计小黄花茶内生真菌的定殖率( colonization rateꎬ
            CR)、 分 离 率 ( isolation rateꎬ IR )、 分 离 频 率         原菌的 PDA 培养基作为对照ꎬ28 ℃ 暗培养 7 dꎮ
                                                               之后用十字交叉法测量病原菌对峙培养的趋向半
            ( isolation frequencyꎬ IF)、 辛 普 森 指 数 ( Simpsons
            diversityꎬ D)、 香 农 - 维 纳 指 数 ( Shannon ̄Weiner      径(r)和单独培养的半径( R)ꎬ计算抑菌率并筛选
            diversity indexꎬ H′)、 Pielous 均 匀 度 指 数 ( Pielous  出具有抑菌性的内生真菌ꎮ
            evenness indexꎬ E )、 Margalefs 丰 富 度 指 数                       R - r
                                                                   抑菌率 =          × 100%ꎮ
            (Margalefs richness indexꎬM)ꎬ并基于小黄花茶内                           R
            生真菌的种类组成ꎬ使用 SPSS 24.0 软件对不同季                           分级标 准:抑 菌 率 > 75% 为 强ꎬ50% ~ 75% 为
            节和部位的内生真菌进行聚类分析ꎮ 通过以上数                             中ꎬ10% ~ 50%为低ꎬ<10%为无ꎮ
            据分析小黄花茶内生真菌的多样性、优势种群、分
            布的均匀程度、丰富度ꎬ以及不同季节和部位间的                             2  结果与分析
            相似水平ꎮ
                 定殖率(CR):长真菌的组织块数量与分离的                         2.1 小黄花茶内生真菌的分离
                                                                   从小黄花茶 324 份组织块中分离得到内生真菌
            组织块总数的比值ꎬ反映植物受真菌浸染的程度ꎮ
                 分离率( IR):某一类菌株的数量与分离的组                        261 株ꎬ由表 1 可知ꎬ小黄花茶内生真菌的总定殖率
            织块总数的比值ꎬ用于度量组织中真菌的丰度以                              和总分离率分别为 71.30%和 80.55%ꎮ 从定殖率来
                                                               看ꎬ不同部位内生真菌定殖率不同ꎬ最高的部位为
            及组织块受浸染的频率ꎮ
                 分离频率( IF):某一类菌株的数量与分离得                        茎 ( 88. 89%)ꎬ 其 次 为 叶 ( 81. 48%)ꎬ 根 最 低
            到的菌株总数的比值ꎬ反映不同种类内生真菌的                              (43.52%)ꎻ 不 同 季 节 定 殖 率 也 不 同ꎬ 冬 季 最 高

            优势程度ꎮ                                              (75. 31%)ꎬ 秋 季 第 二 ( 72. 84%)ꎬ 其 次 为 春 季
                 辛普森指数(D):反映群落中物种的优势度或                         (69.14%)ꎬ夏季最低(67.90%)ꎮ 分离率从高到低

            多样性ꎮ                                               依次为茎(94.44%) >叶(90.74%) >根(56.48%)ꎬ冬
                       S       N i                             (88.89%)>秋(83.95%) >春(76.54%) >夏(72.83%)ꎮ
                          2
                 D = 1-∑P ꎬP =   ꎮ
                          i
                             i
                      i = 1     N                              分离频率茎最高ꎬ占 39.08%ꎻ叶其次ꎬ占 37.55%ꎻ根最
                 香农 - 维 纳 指 数 ( H′): 反 映 群 落 种 类 的 多           低ꎬ占 23.37%ꎮ 按季节从高到低依次为冬(27.59%)>
            样性ꎮ                                                秋(26.05%)>春(23.75%)>夏(22.61%)ꎮ
                       S            N i                        2.2 小黄花茶内生真菌的种群组成
                 H′ = -∑P ×ln P ꎬP =  ꎮ
                         i
                               i
                                  i
                      i = 1         N                              将提取出的真菌基因组 DNA 以 ITS1 和 ITS4
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