Page 182 - 《广西植物》2024年第2期

３ ８ ４ 广 西 植 物 ４４ 卷
目前主要分布在贵州赤水市、四川古蔺县、长宁县 (Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ )、 西 瓜 枯 萎 菌 ( Ｆｕｓａｒｉｕｍ
等地区( 杨雪ꎬ２０１４ꎻ陈锋和王馨ꎬ２０１６)ꎮ 小黄花 ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｎｉｖｅｕｍ ) 、 小 黄 花 茶 致 病 菌
茶花色金黄ꎬ叶片宽厚ꎬ因其性状独特ꎬ具有较高 ( Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃｌｉｖｉｉｃｏｌａ、 Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ) ꎬ 由
的观赏价值ꎬ在园林绿化、盆栽、鲜切花领域都有 四川大学生命科学学院微生物实验室提供ꎮ
不错的发展前景(邹天才ꎬ２０００)ꎮ 然而ꎬ小黄花茶 １.１.３ 主 要 仪 器 立 式 压 力 蒸 汽 灭 菌 器 ( ＬＤＺＸ￣
病害严重ꎬ油茶饼病和鬼帚病是危害其植株健康 ５０ＫＢＳꎬ上海)、全温振荡器( ＨＺＱ￣ＱＸꎬ哈尔滨)、智
的主要病害ꎬ对其经济和观赏价值造成了严重影 能生 化 培 养 箱 ( ＳＰＸꎬ 宁 波)、 电 热 恒 温 水 浴 锅
响(刘清炳等ꎬ２００５)ꎮ 目前ꎬ针对小黄花茶病害的 (ＨＳＧ￣ＩＣ￣２ꎬ浙江)、台式高速离心机( Ｈ１６５０￣Ｗꎬ湖
防治并没有得到深入的研究ꎬ如何安全有效地防 南)、旋转蒸发仪(ＲＥ￣５５２２ꎬ上海)ꎮ
治小黄花茶的病害ꎬ同时对其生境不造成破坏ꎬ是 １.１.４ 主要试剂 无水乙醇、次氯酸钠溶液、乳酸

目前亟须解决的问题ꎮ 小黄花茶作为濒危植物ꎬ 酚棉蓝染色剂、马铃薯葡萄糖水(ＰＤＷ)、真菌基因
对其内生真菌的多样性和抑菌活性进行研究ꎬ一 组 ＤＮＡ 快速抽提试剂盒[生工生物工程( 上海) 股
方面能够回答其内生真菌由哪些种类组成ꎬ不同 份有限 公 司]、 Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍｉｘ 预 混 液 ( ２Ｘ 含 蓝 染
组织部位和不同季节的内生真菌的分布及多样性 料)、通用引物 ＩＴＳ１、ＩＴＳ４[生工生物工程(上海)股
如何ꎬ哪些内生真菌属于优势菌株ꎮ 加强对小黄 份有限公司]、马铃薯葡萄糖琼脂( ＰＤＡ) 培养基
花茶内生真菌资源的了解ꎬ为其内生真菌资源的 (ｓｏｌａｒｂｉｏꎬ美国)ꎮ
开发做铺垫ꎮ 另一方面ꎬ由于小黄花茶数量稀少ꎬ １.２ 试验方法
其病害的防治显得尤为重要ꎬ通过抑菌试验筛选 １.２.１ 小黄花茶内生真菌的分离与纯化 首先ꎬ将
出具有生防潜力的菌株ꎬ不仅能够为小黄花茶的 小黄花茶根、茎、叶洗净后ꎬ进行表面消毒ꎬ将消毒
病害防治开辟一条新的路径ꎬ同时还能缓解因化 后的组织切段ꎬ斜插入 ＰＤＡ 培养基中ꎬ２８ ℃ 恒温
学防治对小黄花茶生境造成的影响ꎮ 暗培养ꎮ 然后ꎬ待菌落长出后ꎬ挑取菌落边缘形态
因此ꎬ本研究以小黄花茶为对象ꎬ采用组织分 质地不同的菌丝于新的 ＰＤＡ 培养基单独培养ꎬ反
离法和分子生物学等方法ꎬ对小黄花茶内生真菌进 复操作 ２ ~ ３ 次ꎬ直至得到单一菌落ꎬ编号后拍照记
行分离鉴定ꎬ分析其内生真菌的多样性ꎬ筛选出优 录菌落特征ꎮ 最后ꎬ将菌丝接入 ＰＤＡ 斜面ꎬ２８ ℃
势菌株和特有菌株ꎬ并通过小黄花茶内生真菌对植 培养一段时间后置于 ４ ℃ 保存ꎮ
物病原真菌抑制作用的探究ꎬ筛选出具有广谱抑菌 表面消毒效果的检测:把最后一遍清洗液涂
活性的菌株ꎬ为小黄花茶病害的防治以及小黄花茶 布在 ＰＤＡ 培养基上ꎬ２８ ℃ 培养 ７ ｄ 后未发现有菌
内生真菌资源的进一步利用提供参考依据ꎮ 落长出ꎬ说明表明消毒彻底ꎬ分离得到的菌株全部
来自植株内部ꎬ属内生真菌ꎮ
１ 材料与方法 １.２.２ 小黄花茶内生真菌的鉴定
１.２.２.１ 形态学鉴定 定期观察 ＰＤＡ 培养基上的
１.１ 试验材料 菌落生长状况和形态特征ꎬ包括形状、质地、颜色、

１.１.１ 供试植物 小黄花茶样品于春( ２０２１ 年 ４ 生长速度等ꎮ 菌落生长初期ꎬ挑取菌落边缘的菌
月)、夏 ( ２０２１ 年 ７ 月)、 秋 ( ２０２１ 年 １０ 月)、 冬 丝孢子于载玻片上ꎬ用乳酸酚棉蓝染色剂进行染
(２０２２ 年 １ 月)４ 个季节采自四川省古蔺县桂花乡 色ꎬ制成玻片后于光学显微镜下观察菌丝形态特

汉溪村(海拔 ９０１ ｍꎬ１０５°４１′１７″ Ｅ、２８°１０′５２″ Ｎ)ꎬ 征、是否产孢、产孢结构的形态特征、产孢方式及
随机选择 ５ 株健康的小黄花茶ꎬ每株采集其根、枝 孢子形态、大小、颜色等ꎮ 根据观察结果ꎬ参照« 真
条、叶片各 ３ 份ꎬ装入无菌样品袋放入冰盒ꎬ带回 菌鉴定手册»(魏景超ꎬ１９７９)和 Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ ｇｅｎｅｒａ ｏｆ

实验室后于 ４ ℃ 环境保存ꎮ ｉｍｐｅｒｆｅｃｔ ｆｕｎｇｉ(Ｂａｒｎｅｔｔ ＆ Ｈｕｎｔｅｒꎬ １９９８)ꎬ结合张永
１.１.２ 供试病原菌 ８ 种供试植物病原真菌分别为 杰等(２０１０)的方法进行鉴定ꎮ 将鉴定后的内生真
茶叶 轮 斑 菌 ( Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ ｔｈｅａｅ )、 尖 孢 镰 刀 菌 菌进行编号ꎬ前两位表示季节和部位的首字母缩
(Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ)、串珠镰刀菌(Ｆ. ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ)、 写ꎬ中间的罗马数字表示所采植物的编号ꎬ最后一
草莓炭疽菌( Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｆｒａｇａｒｉａｅ)、油菜菌核菌 位数字表示所属组织块的编号ꎮ