Page 47 - 《广西植物》2024年第2期

２ 期 张世鑫等: 橡胶树形成层组织的酵母双杂交 ｃＤＮＡ 文库构建及 ＨｂＨＤＡ６ 互作蛋白筛选 ２ ４ ９

平板(含链霉素抗性)上随机挑取 ４ 个大肠杆菌转 凝胶电泳进行 ＰＣＲ 扩增产物的检测ꎬ对扩增得到
化子接种于 ＬＢ 液体培养基ꎬ３７ ℃ 、２２０ ｒｍｉｎ 条 阳性条带的克隆ꎬ进行质粒抽提( Ａｘｙｇｅｎ 质粒小量
￣１
件下振荡培养 １６ ｈ 后ꎬ用 ｐＧＢＫＴ７ 载体的通用引 抽提试剂盒) 和测序ꎮ 插入片段测序结果在比对
物 ｐＧＢＫＴ７￣Ｆ ( ５′￣ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ￣ 确认正确后ꎬ进行后续实验ꎮ 按照表 １ 构建不同
３′)和 ｐＧＢＫＴ７￣Ｒ(５′￣ＴＡＡＧＡＧＴＣＡＣＴＴＴＡＡＡＡＴＴＴ 质粒和涂布不同类型的平板ꎬ将各种质粒转入酵
ＧＴＡＴ￣３′)ꎬ进行 ＰＣＲ 扩增验证ꎬ并使用 １％琼脂糖 母受体菌株 ＡＨ１０９ 中ꎬ观察并检测结果ꎮ

表 １ 构建酵母双杂交文库所需的载体
Ｔａｂｌｅ １ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ￣ｈｙｂｒｉｄ ｌｉｂｒａｒｙ

反应 ＡＤ 载体 ＢＤ 载体 涂板种类 备注
Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＡＤ ｖｅｃｔｏｒ ＢＤ ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏａｔｅｄ ｐｌａｔｅ ｔｙｐｅ Ｎｏｔｅ
１ ｐＧＡＤＴ７￣ｌａｒｇｅＴ ｐＧＢＫＴ７￣ｐ５３ ＳＤ￣Ｔｒｐ￣Ｌｅｕ 阳性对照 Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ
２ ｐＧＡＤＴ７￣ｌａｒｇｅＴ ｐＧＢＫＴ７￣ｌａｍｉｎＣ ＳＤ￣Ｔｒｐ￣Ｌｅｕ 阴性对照 Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ
３ ｐＧＡＤＴ７ ｐＧＢＫＴ７￣ＨｂＨＤＡ６ ＳＤ￣Ｔｒｐ￣Ｌｅｕ 自激活检测 Ｓｅｌｆ￣ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
４ — ｐＧＢＫＴ７￣ＨｂＨＤＡ６ ＳＤ￣Ｔｒｐ 筛库备用 Ｌｉｂｒａｒｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｂａｃｋｕｐ

从 ｐＧＡＤＴ７ ＋ｐＧＢＫＴ７￣ＨｂＨＤＡ６ 共转化 ＡＨ１０９ 体系ꎮ 在 ３０ ℃ 条 件 下 水 浴 孵 育 ３０ ｍｉｎ 后ꎬ 在
长出的酵母转化子中ꎬ随机挑取了 ６ 个菌落ꎬ进行自 ４２ ℃ 条件下水浴热激 ２５ ｍｉｎꎬ在 ３０ ℃ 条件下水浴
激活检测ꎬ包括对 ＨＩＳ３、ＡＤＥ２ 和 ＭＥＬ１ 共 ３ 个报告 复苏 １ ｈꎬ将复苏后的菌液离心并重悬菌体ꎮ 从重
基因的检测ꎮ 对 ＨＩＳ３、ＡＤＥ２ 和 ＭＥＬ１ 报告基因的 悬菌液中取 ２０ μＬ 酵母培养物经梯度稀释后ꎬ分
检测采用点板培养的方法ꎮ 将转化子点板于 ＳＤ￣ 别涂在 ３ 块 ＳＤ￣ＴＬ 平板上ꎬ用于酵母文库的转化
ＴＬ＋Ｘ￣α￣Ｇａｌ 和 ＳＤ￣ＴＬＨＡ 平板ꎬ３０ ℃ 恒温培养 ４ ｄꎬ 效率检测ꎮ 剩余的酵母培养物涂在 ＳＤ￣ＴＬＨ ＋ ５
观察其生长状态ꎮ 在预先配制好的 ＳＤ￣ＴＬＨＡ 板上 ｍｍｏｌＬ ３ＡＴ 平板上ꎬ每块平板涂 ２００ μＬꎬ共涂
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各涂布 ２００ μＬ Ｘ￣α￣Ｇａｌ 溶液ꎬ待 Ｘ￣α￣Ｇａｌ 溶液被平 ４０ 块平板ꎮ 在 ３０ ℃ 条件下恒温倒置培养 ３ ~ ４ ｄꎬ
板培养基完全吸收后ꎬ将转化子菌液进行点板并 观察并记录转化结果ꎬ分析转化效率ꎮ
培养ꎮ １.７ 阳性克隆鉴定和测序分析
１.６ ｐＧＢＫＴ７￣ＨｂＨＤＡ６ 诱饵质粒筛选酵母文库 在 ｐＧＢＫＴ７￣ＨｂＨＤＡ６ 诱饵质粒筛选酵母双杂
用含有测序正确 ｐＧＢＫＴ７￣ＨｂＨＤＡ６ 诱饵质粒 交文库的平板中ꎬ挑取阳性克隆的单菌落ꎬ转接到
的 ＡＨ１０９ 酵母转化子作为受体菌来制备酵母感受 ＳＤ￣ＴＬ 缺陷型培养基平板中ꎬ在 ３０ ℃ 条件下恒温
态细胞ꎮ 将 ＣＯＲ 处理橡胶树形成层组织的 ｃＤＮＡ 倒置培养 ２ ~ ３ ｄꎮ 将在 ＳＤ￣ＴＬ 缺陷型培养基平板
初级文库质粒转入酵母感受态细胞中ꎬ并将其涂 上长出的初始阳性克隆转化子分别用无菌水稀释
在 ＳＤ￣Ｔｒｐ￣Ｌｅｕ￣Ｈｉｓ＋５ ｍｍｏｌＬ ３ＡＴ 平板上并倒置 后ꎬ接种到 ＳＤ￣ＴＬ 和 ＳＤ￣ＴＬＨＡ＋Ｘ￣α￣Ｇａｌ 缺陷平板
￣１
培养ꎮ 从 ＳＤ￣Ｔｒｐ 平 板 挑 取 单 克 隆 菌 斑ꎬ 接 种 在 上ꎬ进行 ＨＩＳ３、ＡＤＥ２ 和 ＭＥＬ１ 报告基因的检测ꎬ在
ＳＤ￣Ｔｒｐ 液体培养基中ꎬ在 ３０ ℃ 、２２０ ｒｍｉｎ 条件 ３０ ℃ 条件下恒温培养 ３ ~ ４ ｄꎮ
￣１
下振荡培养 １８ ｈꎬ再转接到 ＹＰＤＡ 培养基中培养ꎬ 对 ＨＩＳ３、ＡＤＥ２ 和 ＭＥＬ１ 报告基因进行检测ꎬ
使用紫外分光光度计ꎬ测定菌液测定初始浓度为 显示结果为阳性对照在 ＳＤ￣ＴＬ 和 ＳＤ￣ＴＬＨＡ＋Ｘ￣α￣
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ＯＤ ＝ ０.２ꎻ在 ３０ ℃ 、２２０ ｒｍｉｎ 条件下振荡培养 Ｇａｌ 缺陷型培养基平板上都能正常生长ꎬ并且 ＳＤ￣
６００
４ ~ ５ ｈꎬ中途使用紫外分光光度计测定菌液的浓 ＴＬＨＡ＋Ｘ￣α￣Ｇａｌ 缺陷型培养基平板上的菌落呈现
度ꎬ当菌液浓度达到 ＯＤ ＝ ０.６ 即停止培养ꎮ 将菌 蓝色ꎻ阴性对照由于不会激活 ＨＩＳ３ 和 ＡＤＥ２ 报告
６００
液离心并弃上清ꎬ重悬菌体ꎮ 按照加入试剂的体 基因ꎬ虽然在 ＳＤ￣ＴＬ 缺陷型培养基平板上可以正
积从大到小ꎬ依次加入 ９.６ ｍＬ 的 ５０％ ＰＥＧ３３５０ꎬ 常生长ꎬ但菌落不呈现蓝色ꎬ而在缺少 Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ 和
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１.４４ ｍＬ 的 １ ｍｏｌＬ ＬｉＡｃꎬ３００ μＬ 的 ｓｓＤＮＡ (１０ Ａｄｅｎｉｎｅ 这两种成分的 ＳＤ￣ＴＬＨＡ＋Ｘ￣α￣Ｇａｌ 缺陷型
ｍｇｍＬ ) ꎬ以及 ２５ μｇ 的文库质粒 ＤＮＡꎬ并混匀 培养基平板上不能生长ꎮ 因此ꎬ初始阳性克隆能
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