Page 51 - 《广西植物》2024年第2期
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２ 期      张世鑫等: 橡胶树形成层组织的酵母双杂交 ｃＤＮＡ 文库构建及 ＨｂＨＤＡ６ 互作蛋白筛选                                      ２ ５ ３

            ２.４ 阳性克隆鉴定和互作蛋白分析                                  质ꎬ绝大多数形成层区细胞呈长梭形且排列紧密ꎮ
                 为了鉴定 ｐＧＢＫＴ７￣ＨＤＡ６ 诱饵质粒筛选到的                     因此ꎬ从有限的组织材料中ꎬ也能提取出含量较
            阳性克隆基因信息ꎬ将以上阳性克隆菌株分别接                              高、质量较好总 ＲＮＡꎮ 后续使用成熟的磁珠法技
            入 ＳＤ￣ＴＬ 液体培养基中振荡培养过夜并提取纯化                          术分离纯化 ｍＲＮＡꎬ获得的 ｍＲＮＡ 捕获率和成功
            酵母质粒ꎬ再将抽提得到的酵母质粒转化到大肠                              率都很高( Ａｌｂｒｅｔｓｒｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９９０)ꎬ保证了后续构
            杆菌 Ｔｏｐ１０ 新鲜感受态细胞中进行扩增ꎬ将含有                          建酵母双 杂 交 ｃＤＮＡ 文 库 研 究 所 需 的 高 质 量 总
            阳性克隆的 Ｔｏｐ１０ 转化子转接 ＬＢ 液体培养基中                        ＲＮＡ 和 ｍＲＮＡꎮ 使用 ｍＲＮＡ 反转录合成 ｃＤＮＡꎬ在

            扩增后抽提大肠杆菌质粒ꎬ进行 ＤＮＡ 测序分析ꎬ                           均一化前后都进行一轮 ＬＤ￣ＰＣＲꎬ这样通过两轮的
            并与 ＮＣＢＩ＿ＧｅｎＢａｎｋ 数据库中的序列进行 ＢＬＡＳＴ                    ＬＤ￣ＰＣＲ 放大ꎬ不但能够保证在起始总 ＲＮＡ 较少
            比对分析ꎮ ＢＬＡＳＴ 比对结果( 表 ２) 显示ꎬ筛选到                      的情况下纯化收集到足够量的 ｃＤＮＡ 用于文库构

            与 ＨｂＨＤＡ６ 基因相互作用的阳性克隆质粒 ＤＮＡꎬ                        建ꎬ而且能够使低丰度的基因得到增加ꎬ相应地提
            去除重复外ꎬ分别属于 ２２ 种蛋白编码基因ꎮ                             高了 筛 库 筛 到 低 丰 度 基 因 的 概 率 ( 杨 子 平 等ꎬ
                 根 据 ＵｎｉＰｒｏｔ 的 蛋 白 信 息 预 测ꎬ 可 将 与              ２０１３ꎻ余海洋等ꎬ２０１６)ꎮ
            ＨｂＨＤＡ６ 互作的 ２２ 种蛋白分为氧化还原酶、水解                            对酵母双杂交 ｃＤＮＡ 文库质量评判主要从 ３
            酶、蛋白 / ＤＮＡ / ＲＮＡ 结合、运输、异构酶、染色质调                    个重要的数据来分析ꎬ分别为酵母双杂交文库的
            节剂和糖蛋白 ７ 个类别ꎬ其中水解酶、氧化还原                            单克隆数、重组率和插入片段长度ꎮ 酵母双杂交
            酶、蛋白 / ＤＮＡ / ＲＮＡ 结 合 ３ 个 类 别 的 蛋 白 较 多ꎮ            文库的单克隆数代表了构建的 ｃＤＮＡ 文库完整性
            根据亚细胞定位的结果显示这 ２２ 种蛋白在细胞                            和覆盖度ꎬ插入片段的长度代表了 ｃＤＮＡ 文库包含
            各个部位都有分布ꎬ其中亚细胞定位在细胞膜、叶                             基因的完整性( Ｖａｎ ＆ Ｂｅｙａｅｒｔꎬ １９９６)ꎮ ｃＤＮＡ 文
            绿体、线粒体和细胞核 ４ 个类别的蛋白相对较多ꎮ                           库的单克隆是保证 ｃＤＮＡ 文库完整性和覆盖度的
                                                               一个重要指标ꎬ文库单克隆数大于 １×１０ 是文库筛
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            ３  讨论与结论                                           选所必须的(李可琪等ꎬ２０１６)ꎮ 一方面ꎬ本文中利
                                                               用 Ｇａｔｅｗａｙ 技术构建了茉莉酸诱导橡胶树次生乳
                                                                        ＴＭ
                 从动植物组织或细胞中提取的总 ＲＮＡ 和纯化                        管分化形成层组织的均一化酵母双杂交 ｃＤＮＡ 文
            的 ｍＲＮＡ 是构建酵母双杂交 ｃＤＮＡ 文库的起始材                        库ꎬ初级文库容量为 ６.３４×１０ ＣＦＵｍＬ ꎬ总单克
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            料ꎬ能够获得高质量的总 ＲＮＡ 和 ｍＲＮＡ 是构建高                        隆数为 １. ２７ × １０ ꎬ次 级 文 库 的 容 量 为 ７. ７２ × １０   ６
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            质量酵母 双 杂 交 ｃＤＮＡ 文 库 的 前 提 ( Ｇａｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ            ＣＦＵｍＬ ꎬ总单克隆数为 １.５４×１０ ꎬ文库重组率
            ２０１４)ꎮ 本研究中的橡胶树树皮的维管形成层组                           均为 １００％ꎬ这些数值均要高于酵母双杂交 ｃＤＮＡ
            织是夹在韧皮部和木质部之间ꎬ为几层至十几层                              文库构建的基本要求ꎮ 另一方面ꎬ构建的酵母双
            形成层纺锤状细胞组成且排列精密ꎬ较难获取到                              杂交 ｃＤＮＡ 初级文库和次级文库的插入片段平均
            完整且纯净的形成层组织ꎮ 前期研究中ꎬ我们发                             长度分别为 １.１ ｋｂ 和 １.２ ｋｂꎬ这个数值是接近于本
            现橡胶树萌条形成层细胞层数有明显规律ꎬ在海                              文使用的橡胶树热研 ７￣３３￣９７ 基因组序列中公布
            南岛每年春季新梢生长期(３—４ 月)ꎬ树干的形成                           的 ＣＤＳ 平均长度(Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６)ꎮ 由此可见ꎬ
            层区开始分裂分化活动ꎬ此时形成层的细胞层数                              本文构建的 ＣＯＲ 处理橡胶树萌条树皮形成层组织
            最少(约 ４ 层) ( Ｗｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００２)ꎬ而 ７—８ 月正值             的酵母双杂交文库的单克隆数、重组率和插入片
            高温高湿环境ꎬ利于橡胶树萌条生长和维管形成                              段长度均达到较高水平ꎬ满足酵母双杂交文库筛
            层细胞 分 裂 活 动ꎬ 此 时 形 成 层 的 细 胞 层 数 量 多               选的工作ꎮ
            (１０ ~ １１ 层) ( 张世鑫等ꎬ２０１１)ꎮ 本文在 ７—８ 月                    前期 研 究 中ꎬ 本 团 队 最 早 发 现 外 施 茉 莉 酸
            时ꎬ采集萌条 ＥＵ３ 的节间树皮样品ꎬ此时的形成层                          (ＪＡ)及其前体亚麻酸( ＬＡ) 能诱导形成层细胞分
            细胞量多且 ＥＵ３ 的次生韧皮部未分化出次生乳                            化次生乳管(Ｈａｏ ＆ Ｗｕꎬ ２０００ꎻＴｉａｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００３)ꎬ
            管ꎬ能够获得量多且纯净的形成层区组织ꎮ 使用                             与茉莉酸的活性形式 ＪＡ￣Ｉｌｅ 结构相似的 ＣＯＲ 可以
            冰冻切片弦切获取形成层区组织ꎬ光学镜检发现                              与 ＣＯＩ１ 受体结合ꎬ激活 ＪＡ 信号途径(Ｋａｔｓｉｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ
            冰冻切片得到橡胶树树皮的形成层区组织没有杂                              ２００８)ꎬ其诱导橡胶树乳管分化的效应比 ＭｅＪＡ 更
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