Page 71 - 《广西植物》2024年第7期

７ 期 周文才等: 浙江红花油茶 × 广宁红花油茶杂交子代的表型性状及其 ＳＳＲ 分子鉴定 １ ２ ７ １

子代鉴定的方法主要有形态特征、染色体计 本经常规杂交后获得 ４５ 株 Ｆ 子代ꎮ 杂交子代为 ５
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数、荧光原位杂交和分子标记等ꎮ 根据杂交子代 年生实生苗ꎬ栽植于江西省林业科学院试验基地ꎮ
的表型来判断子代的真实性是最基本的方法ꎮ 该 每份样本采集 ３ ~ ５ 片嫩叶ꎬ并保存于－８０ ℃ 超低
方法具有直观便捷的优点ꎬ但鉴定周期长且易受 温冰箱待用ꎮ 利用改良 ＣＴＡＢ 法( 温强等ꎬ２００６)
观察者主观和栽培环境影响ꎬ无法保证鉴定结果 提取 ＤＮＡ 后ꎬ用 １％的琼脂糖凝胶电泳检测 ＤＮＡ
的准确性( Ｙｅ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１３ꎻＤｒｉｄｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１８)ꎮ 细 质量ꎬＮａｎｏｄｒｏｐ ２０００ ( Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃꎬ ＵＳＡ) 检
胞学方法中的荧光原位杂交及染色体计数具有较 测 ＤＮＡ 的浓度和纯度ꎬ将 ＤＮＡ 浓度稀释至 １００
高的鉴定效率ꎬ但操作繁杂、费时费力ꎮ 分子标记 ｎｇ μＬ ꎬ于－２０ ℃ 保存备用ꎮ
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鉴定不仅具有鉴定效率高、操作简便、不受栽培环 １.２ ＳＳＲ 引物设计和 ＰＣＲ 扩增
境和生长发育条件的影响等优点ꎬ还可明确子代 基于浙 江 红 花 油 茶 全 长 转 录 组 序 列ꎬ 利 用
和亲本的基因型ꎬ从基因组的水平上揭示子代与 Ｐｒｉｍｅｒ ３.０ 软件进行 ＳＳＲ 引物设计ꎮ 引物 ＰＣＲ 扩增
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双亲间的遗传差异( Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１０ꎻＫｈａｊｕｄｐａｒｎ 体系为 １０ μＬ:１０ × Ｂｕｆｆｅｒ １.０ μＬꎬＭｇ (２５ ｍｍｏｌ
ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１２ꎻＫｈａｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１３)ꎮ 分子标记中的简 Ｌ ) １. ０ μＬꎬ ｄＮＴＰｓ ( １０ ｍｍｏｌ Ｌ ) １. ０ μＬꎬ １０
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单重复序列(ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔｓꎬＳＳＲ)标记ꎬ由 μｍｏｌＬ 的 Ｐｒｉｍｅｒ￣Ｆ、Ｐｒｉｍｅｒ￣Ｒ 各 ０.４ μＬꎬＴａｑ 酶
于具有共显性、重复性好、稳定可靠、操作简单等 (５ ＵμＬ ) ０.１ μＬꎬＤＮＡ 模板(１００ ｎｇμＬ ) ０.５
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优 点ꎬ 因 此 也 已 被 广 泛 应 用 于 茶 树 ( 雷 雨 等ꎬ μＬꎬ加灭菌 ｄｄＨ Ｏ 补齐到 １０ μＬꎮ ＰＣＲ 扩增程序:
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２０２１)、沙 田 柚 ( 韩 国 辉 等ꎬ２０１０)、菊 花 ( 刘 颖 鑫 ９４ ℃预变性 ５ ｍｉｎꎻ９４ ℃变性 ３０ ｓꎬ５７ ~６０ ℃ (因不
等ꎬ２０１９)等物种的杂种鉴定ꎮ 然而ꎬ由于油茶杂 同引物而异)退火 ３０ ｓꎬ７２ ℃ 延伸 ３０ ｓꎬ共 ２５ 个循
交群体不易获得ꎬ有关杂种后代鉴定的研究鲜有 环ꎻ７２ ℃ 延伸 １ ｍｉｎꎬ４ ℃ 保存ꎮ ＰＣＲ 扩增产物用
报道ꎬ只是在同属的物种中有利用 ＳＳＲ 标记鉴定 ８％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测ꎬ１５０ Ｖ 电压电泳 ９０
杂交子代的研究报道ꎬ徐晶等(２００９) 利用分别来 ｍｉｎ 后进行银染显色ꎬ并拍照记录ꎮ
自叶绿体 ＤＮＡ、ｒＤＮＡ 的内部转录间隔区和核基因 １.３ 引物的筛选和可靠性验证
组共 ５ 个 ＳＳＲ 标记ꎬ对金花茶(Ｃ. ｎｉｔｉｄｉｓｓｉｍａ) × 七 经过初步 ＰＣＲ 扩增筛选出 ３２ 个条带清晰、多
星 白 ( Ｃ. ｊａｐｏｎｉｃａ ) 以 及 金 花 茶 × 茶 梅 ( Ｃ. 态性好的标记ꎮ 经 ２ 个亲本以及 ６ 个杂交子代样
ｓａｓａｎｑｕａ)的 ６ 个杂交子代进行杂种鉴定ꎬ鉴定效 本筛选出可区分双亲和子代并能明确子代位点来
率为 ８３.３３％ꎮ 源的 ＳＳＲ 标记ꎬ用于后续的 ４５ 个 Ｆ 子代样本的扩
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本研究以油茶杂交育种及品种分子鉴定为研 增ꎮ 为确保杂交子代鉴定试验结果的可靠性ꎬ选
究区域ꎬ以浙江红花油茶为母本ꎬ广宁红花油茶为 取 ３ 个广宁红花油茶样本 (非父本)和 ３ 个浙江红
父本ꎬ采用人工杂交获得 ４５ 株 Ｆ 子代ꎬ通过对杂 花油茶样本( 非母本) 对杂交子代鉴定效率低的
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交子代进行表型测定ꎬ同时筛选 ＳＳＲ 标记并利用 ＳＳＲ 标记进行可靠性验证ꎮ 双亲和杂交子代的等
该标记开展杂交子代的鉴定ꎬ拟探讨:(１) 浙江红 位基因用 Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ 英文字母表示ꎮ
花油茶 × 广宁红花油茶的杂交子代表型偏向父本
或母本ꎬ还是介于父母本之间ꎻ(２) 能否获得适于 ２ 结果与分析
油茶种间杂种鉴定的特异 ＳＳＲ 标记ꎻ(３) ＳＳＲ 标记
能否对浙江红花油茶 × 广宁红花油茶杂交子代进 ２.１ 杂交子代表型性状
行真伪鉴定及其鉴定效率ꎮ 以期为油茶物种间的 浙江红花油茶 × 广宁红花油茶的 Ｆ 子代在表
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杂交育种提供参考ꎬ同时也为后续油茶物种间的 型上表现为亲本性状中间型ꎬ从整体看树形高大、

杂交子代 ＳＳＲ 标记鉴定提供依据ꎮ 生长迅速更倾向于父本广宁红花油茶的性状( 表
１ꎬ图 １)ꎮ Ｆ 子代的枝、叶及叶柄光滑无毛ꎬ老枝灰
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１ 材料与方法 白色ꎬ新梢红色ꎻ叶片绿色略偏黄ꎬ薄革质ꎬ椭圆或
长椭圆形ꎬ侧脉约 ８ 对ꎬ叶脉明显ꎬ边缘 ３ / ４ 有锯
１.１ 试验材料和 ＤＮＡ 提取 齿ꎻ子代播种种植后第 ４ 年开花ꎬ花顶生单花ꎬ红
以广宁红花油茶为父本ꎬ浙江红花油茶为母 色ꎬ 花冠直径 ７ ~ ８ ｃｍꎬ花瓣 ７ ~ ８ 片ꎬ 柱头 ５ 裂、中