Page 209 - 《广西植物》2025年第10期
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１０ 期 郁培义等: 菌根化马尾松转录组差异分析 １ ９ ３ ９
微镜进行观察确认ꎬ未发现其他外生菌ꎬ进行各项 ２ １００系统进行纯化和定量ꎮ 对 ｃＤＮＡ 文库在高通
生理指标测定及转录组测序ꎮ 量 Ｉｌｌｕｍｉｎａ 测序平台上测序ꎮ 所有经 Ｉｌｌｕｍｉｎａ 测序
１.２ 马尾松生理生长指标分析 的序列ꎬ包括低质量序列、Ｎ 过多的序列以及 Ｑ２０
１.２.１ 生长指标测定 接种处理组和未接种处理 碱基超过 １０％的读取ꎬ必须从数据库中过滤出来ꎬ
组随机选择长势一致的马尾松幼苗 ３ 株ꎬ先分别 剩余的高质量的序列为可用的原始数据ꎮ 使用
用直尺和游标卡尺测定不同处理菌根化和非菌根 Ｔｒｉｎｉｔｙ ｓｏｆｔｗａｒｅ 软 件 将 所 有 Ｃｌｅａｎ ｒｅａｄｓ 组 装 成
化马尾松的苗高和根长ꎬ 再用电子分析天平测定 Ｕｎｉｇｅｎｅｓꎮ
幼苗的茎叶重ꎮ １.３.３ 功能基因注释 对组装好的 Ｕｎｉｇｅｎｅｓ 进行
１.２.２ 叶绿素及抗氧化酶含量测定 ＢＬＡＳＴ 比对ꎬＥ 值阈值设定为 １０ ꎬ对以下 ５ 个公
￣５
１.２.２.１ 马尾松针叶光合色素含量测定 采用丙酮 共蛋白质数据库进行注释:去冗余蛋白质数据库
研磨法ꎬ参照 Ｗｉｌｌｉａｍ 和 Ｐａｕｌ (１９８５) 的方法ꎬ利用 (ＮＲ)、基因功能描述分类系统数据库( ＧＯ)、基因
紫外分光光度计分别测定滤液在波长 ６６３ ｎｍ、６４６ 产物直系同源分类的数据库( ＫＯＧ)、京都基因与
ｎｍ 和 ４７０ ｎｍ 处的吸光值ꎬ以此来计算样品叶绿 基因组百科全书蛋白质数据库( ＫＥＧＧ)、高质量蛋
素和胡萝卜素的含量ꎮ 白数据库(Ｓｗｉｓｓ￣Ｐｒｏｔ)ꎬ每个组装序列根据 ＢＬＡＳＴ
１.２.２.２ 马尾松幼苗抗氧化酶含量测定 参照张龙 最高分命名对应的基因名称ꎮ
翔 等 ( ２００５ ) 的 方 法ꎬ 用 氮 蓝 四 唑 ( ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ １.３.４ 差异基因表达量分析 采用差异表达测序
ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍꎬ ＮＢＴ) 还 原 法 测 定 超 氧 化 物 歧 化 酶 方 法 筛 选 差 异 表 达 基 因 ( ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
(ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅꎬ ＳＯＤ) 活性ꎻ用愈创木酚法 ｇｅｎｅｓꎬ ＤＥＧｓ)ꎮ 以每百万 ｆｒａｇｍｅｎｔｓ 中来自某一基
测定过氧化物酶( ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅꎬ ＰＯＤ) 活性ꎻ用紫外 因平均 每 一 千 碱 基 长 度 的 片 段 数 目 ( ｒｅａｄｓ ｐｅｒ
吸收法测定马尾松在紫外分光光度计 ２４０ ｎｍ 处 ｋｉｌｏｂａｓｅ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓꎬ ＲＰＫＭ) 来 统 计
的吸光值ꎬ以此来测定过氧化氢酶(ｃａｔａｌａｓｅꎬ ＣＡＴ) ｕｎｉｑｕｅ 表达水平ꎬ对转录本丰度进行归一化处理ꎬ
活性ꎮ 消除不同基因长度和序列差异对基因表达计算的
１.３ 马尾松转录组测序分析 影响ꎮ ＲＰＫＭ 的 ３ 倍水平被用来鉴定接种组和对
１.３.１ 总 ＲＮＡ 提取 使用液氮将每个处理( 接种 照组 ２ 个不同处理之间表达差异的基因ꎬ最后对
和未接种)的新鲜马尾松根系(１ ~ ２ ｇ) 磨成粉末ꎬ 选取的差异基因进行 ＧＯ 功能分析和 ＫＥＧＧ 代谢
每个处理 ３ 个重复ꎮ 根据操作流程ꎬ使用植物总 通路分析ꎮ
ＲＮＡ 纯化试剂盒( Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈꎬ Ｃｏ. Ｌｔｄ.) 分离 １.３.５ 定量 ＲＴ￣ＰＣＲ 根据 ＧＯ 和 ＫＥＧＧ 的代谢通
和纯 化 总 ＲＮＡꎮ 提 取 的 总 ＲＮＡ 使 用 Ｎａｎｏｄｒｏｐ 路数据库联合筛选出 ４ 个参与菌根共生不同调控模
ＮＤ￣２０００ 分光光度计和 Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００ 系 式的差 异 基 因 进 行 ＲＴ￣ｑＰＣＲ 验 证ꎮ 使 用 Ｐｒｉｍｅｒ
统进行定量ꎬ通过比对公共数据库识别非宿主来 Ｐｒｅｍｉｅｒ ５.０ 软件设计基因特异性引物对(表 １)ꎮ 从
源的 ＲＮＡ 序列ꎬ将所得数据进行生物信息学过滤 不同处理马尾松分离总 ＲＮＡꎬ使用 ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ
去除非宿主序列ꎮ 样品的 ２６０ / ２８０ ｎｍ 比值均在 Ｔａｑ Ｋｉｔ 试 剂 盒 合 成 ｃＤＮＡꎬ 选 择 ＡＣＴＲ３ 和 １８Ｓ
２.０ 左右ꎬ平均 ＲＮＡ 完整性数( ＲＩＮ) >８ꎬ表明提取 ｒＲＮＡ 作为内参基因ꎮ 反应条件:９５ ℃ ２ ｍｉｎ、９５ ℃
的 ＲＮＡ 质量较高ꎬ能够进行下一步 ｃＤＮＡ 文库构 １５ ｓ、６０ ℃ １５ ｓ、９５ ℃ １５ ｓꎬ 进行 ４０ 个循环ꎮ 采用
建和测序ꎮ ΔΔＣｔ 法计算各单基因 ＲＴ￣ｑＰＣＲ 结果的相对表达
１.３.２ ｃＤＮＡ 文库构建及 Ｉｌｌｕｍｉｎａ 高通量测序 使用 量ꎬ并利用 ＪＭＰ 对 ＲＰＫＭ 与－２ ΔΔＣｔ 进行相关性分析ꎮ
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ 试剂盒构建 ｃＤＮＡ 文库ꎮ 主
２ 结果与分析
要步骤如下:按照操作手册要求ꎬ使用寡聚珠( ｄＴ)
从总 ＲＮＡ 中分离 ｐｏｌｙ￣(Ａ) ｍＲＮＡꎮ 双链 ｃＤＮＡ 通
过随机六聚体引物逆转录生成ꎬｃＤＮＡ 接头合成通 ２.１ 马尾松生理生长分析
过 ＤＮＡ 聚合酶 Ｉ 和 ＲＮａｓｅ Ｈꎮ 随后ꎬ通过凝胶电 从表 ２ 可以看出ꎬ通过测定接种和未接种马尾
泳选择长度约为 ２００ ｂｐ 的 ｃＤＮＡ 片段ꎬ进行 ＰＣＲ 松各项生长及生理指标ꎬ得出接种条件下马尾松
扩增ꎮ 富集的 ｃＤＮＡ 片段使用 Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ 生长得到有效改善( 表 ２) ꎮ 与未接种对照处理相
