Page 147 - 《广西植物》2025年第2期
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２ 期       展莉平等: 基于 ＦＵＮＧｕｉｌｄ 的山药腐烂块茎真菌群落研究及潜在病原真菌的分离鉴定                                       ３ ４ ９

            郭晗玥等(２０２３)通过对不同连作时间的西瓜土壤                           法ꎬ铵态氮( ａｍｍｏｎｉａ ｎｉｔｒｏｇｅｎꎬ１１０.２４ ｍｇｋｇ )、
                                                                                                         ￣１
            微生物群落进行功能预测发现ꎬ西瓜连作 ６ 茬土                            硝态氮(ｎｉｔｒａｔｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎꎬ５４.７２ ｍｇｋｇ ) 和亚硝态
                                                                                                 ￣１
            壤中病理型真菌被显著富集ꎬ植物病原真菌生态                              氮( ｎｉｔｒｉｔｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎꎬ ３. １２ ｍｇ  ｋｇ ) 参 考 Ｚｈｏｕ 等
                                                                                             ￣１
            功能类群丰度明显提高ꎬ其可能通过损伤宿主细                              (２０２１)对秸秆覆盖土壤理化性质的测定方法ꎮ
            胞获取营养ꎬ导致西瓜真菌病害的发生ꎮ 因此ꎬ将                            １.３ 样品的处理
            高通量测序与 ＦＵＮＧｕｉｌｄ 分析相结合是一种阐明                             山药块茎用流水冲洗干净后ꎬ在病健交界处

            植物疾病与真菌群落间关系的有效策略ꎮ                                 切取 ０.５ ｃｍ × ０.５ ｃｍ 组织块ꎬ并进行表面消毒:
                 目前ꎬ已被证实与山药块茎腐烂密切相关的                           ７５％酒精表面消毒 ３０ ｓꎬ０.１％升汞消毒 ４ ~ ５ ｍｉｎꎬ

            病原菌主要包括镰刀菌、青霉和曲霉( Ｐｏｐｏｏｌａ ｅｔ                       无菌水漂洗 ３ ~ ４ 次ꎮ 取最后 １ 次漂洗的无菌水
            ａｌ.ꎬ ２０１９ꎻ Ｕｙ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２２ꎻ Ｌｉ ＰＦ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２３)ꎮ   １００ μＬ 涂布于 ＰＤＡ 培养基ꎬ确认表面消毒彻底
            此 外ꎬ 零 星 报 道 认 为 可 可 色 二 孢 ( Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａ         后ꎬ取组织块装入无菌 ＥＰ 管ꎮ 送至上海美吉生物
            ｔｈｅｏｂｒｏｍａｅ)、齐整小核菌( Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉ) 和群结         医药科技有限公司ꎬ提取 ＤＮＡ 并进 行 质 量 鉴 定
            腐霉(Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍｙｒｉｏｔｙｌｕｍ) 等也是引起山药块茎腐                  后ꎬ利用 Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ 平台ꎬ使用引物 ＩＴＳ１Ｆ(ＣＴ
            烂的病原真菌(Ｄａｎｉａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６ꎬ ２０２０ꎻ Ｚｈａｎｇ ｅｔ          ＴＧＧＴＣＡＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴＡＡ) / ＩＴＳ２Ｒ(ＧＣＴＧＣＧＴＴ
            ａｌ.ꎬ ２０１８)ꎮ 然而ꎬ已有研究均集中在病原真菌的                       ＣＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣ)进行 ＩＴＳ 扩增子测序ꎮ
            分离鉴定方面ꎬ尚未有研究对山药腐烂块茎的真                              １.４ 高通量测序数据的生物信息学分析
            菌群落组成、生态功能类群和潜在病原真菌进行                                  利用上海美吉生物医药科技有限公司云平台
            全面的评价和分析ꎮ                                          (ｈｔｔｐｓ: / / ｃｌｏｕｄ.ｍａｊｏｒｂｉｏ. ｃｏｍ / ) 进行高通量数据的
                 本研究联合使用 Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ 高通量测序、                 分析和处理ꎮ 利用 ＦＬＡＳＨ １.２.１１、ＱＩＩＭＥ １. ９. １、
            ＦＵＮＧｕｉｌｄ 分析与组织分离培养技术ꎬ拟探讨以下                         ＵＣＨＩＭＥ ８.１ 对原始数据进行质控拼接、数 据 优
            问题:(１)腐烂山药块茎中的真菌群落组成及生态                            化ꎬ选择去除错误序列后覆盖度 １００％、相似度大
            网络特征ꎻ(２)腐烂山药块茎中的真菌生态功能类                            于 ９８％ 的 序 列 进 行 ＡＳＶ 扩 增 子 测 序 变 异 聚 类
            群、代表性物种及其 Ｔｒａｉｔ 致病特性ꎻ(３) 潜在病原                      (Ｔｉｐｔｏｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２１)ꎮ 利用 Ｕｎｉｔｅ 真菌数据库进行
            真菌的分离鉴定ꎮ 本研究将加深对腐烂山药块茎                             真菌物种注释ꎮ 利用 ｐｓｙｃｈ、ｍｉｃｒｏｅｃｏ Ｒ 包计算真
            中真菌群落生态功能的理解ꎬ为阐明山药块茎腐                              菌群落相关性ꎬ软件 ｇｅｐｈｉ ０. １０. １ 及 ｇｇＣｌｕｓｔｅｒＮｅｔ
            烂的发病规律、定向使用农药及筛选生防菌提供                              和 ＷＧＣＮＡ 等 Ｒ 包 进 行 数 据 可 视 化ꎮ 利 用
            参考依据ꎮ                                              ＦＵＮＧｕｉｌｄ 数 据 库 ( ｈｔｔｐ: / / ｓｔｂａｔｅｓ. ｏｒｇ / ｆｕｎｇｕｉｌｄ ＿
                                                               ｄｂ.ｐｈｐ)与 Ｒ ｓｔｕｄｉｏ 结合ꎬ预测腐烂山药块茎真菌
            １  材料与方法                                           生态功能结构ꎮ

                                                               １.５ 腐烂山药真菌的分离纯化
            １.１ 材料                                                 将 ０.５ ｃｍ × ０.５ ｃｍ 病健交界处组织块消毒彻
                 供试样品: 于 ２０２１ 年 １１ 月采自河南省焦作                    底后ꎬ用无菌研钵破碎ꎬ置于 ５ ｍＬ 的无菌水中ꎬ混

                                                                                                       ￣１   ￣２
            市温县山药种质资源圃(１１２°９８′２２″ Ｎ、３４°９４′６８″                  合均匀ꎮ 以 １０ 倍梯度稀释ꎬ取制备原液、１０ 、１０
            Ｅ)ꎬ将种植区域等分为 ６ 个区域ꎬ在每个区域中采                          和 １０  ￣３  ４ 个梯度ꎬ涂布于 ＰＤＡ 培养基ꎬ置于 ２８ ℃
            集山药腐烂块茎ꎬ如图 １ 所示ꎮ 将腐烂块茎放入                           恒温黑暗培养 ５ ~ ７ ｄꎬ挑取形态、颜色等不同的菌

            无菌自封袋ꎬ于冰盒中保存ꎬ带回实验室放入 ４ ℃                           落ꎬ使用划线法进行分离纯化ꎬ直至获得单一菌
            保存备用ꎮ                                              落ꎮ 分 离 纯 化 后 的 菌 株 用 于 菌 种 保 藏 和 ＤＮＡ
            １.２ 土壤理化性质测定                                       提取ꎮ

                 土 壤 ｐＨ ( ６. ６３ )、 总 磷 ( ｔｏｔａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓꎬ     １.６ 不同形态菌株 ＤＮＡ 提取与鉴定
                           ￣１                                      按照 ＤＮＡ 提取试剂盒( ＯＭＥＧＡ ＢＩＯ) 的方法
            ２１３.２５４ ｍｇｋｇ )、总有机质( ｔｏｔａｌ ｏｒｇａｎｉｃ ｍａｔｔｅｒꎬ
                           ￣１
            ４１０.００ ｍｇ  ｋｇ )、 速 效 磷 ( ａｖａｉｌａｂｌｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓꎬ   提取不同形态真菌 ＤＮＡꎮ 采用真菌通用引物 ＩＴＳ１
                          ￣１
            １３. ８８ ｍｇ  ｋｇ ) 和 有 效 钾 ( ａｖａｉｌａｂｌｅ ｐｏｔａｓｓｉｕｍꎬ   (ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ) / ＩＴＳ４(ＴＣＣＴＣＣＧＣ
            ３００.２８ ｍｇｋｇ ) 的测定参考鲍士旦(２０００) 的方                  ＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ) 对 菌 株 的 ＩＴＳ 区 进 行 扩 增ꎬ 使
                          ￣１
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