Page 7 - 《广西植物》2025年第4期
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４ 期       付晓莹等: 中国特有种勐海冷水花(荨麻科)的重新发现、补充描述及其系统位置探讨                                           ６ ２ １

            物种的分类学研究较少ꎬ进而阻碍了对该种的保                              与组装以获得完整的叶绿体基因组与核糖体基因
            护和植物资源开发与利用ꎮ                                       组数据(Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０)ꎮ 使用 ＩＴＳｘ( ｖ.１.１.３) 进
                ２０２３ 年ꎬ笔者在中国科学院西双版纳热带植                         行 ＩＴＳ 序列提取(Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ￣Ｐａｌｍｅ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１３)ꎬ利
            物园关注到 ２ 株于 ２０１９ 年引种自勐海曼稿保护区                        用在线注释软件 ＣＰＧＡＶＡＳ２( Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１９) 以
            的形态独特的冷水花属植物ꎬ经标本比对和形态                              镜面 草 ( Ｐｉｌｅａ ｐｅｐｅｒｏｍｉｏｉｄｅｓ) ( ＧｅｎＢａｎｋ 登 录 号 为
            比较ꎬ确认为“消失”许久的勐海冷水花ꎬ在随后的                            ＮＣ＿０５４３３９.１)的叶绿体基因组作为近缘参考基因
            ２０２４ 年 １ 月ꎬ在该种模式产地采集到雌株和果序                         组进行注释ꎬ使用 ＯＧＤＲＡＷ( Ｇｒｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１９)
            标本ꎮ 该文旨在利用分子和形态学证据对该种进                             绘制勐海冷水花的叶绿体基因组图谱ꎮ
            行系统位置探讨和形态补充描述ꎬ补充中国冷水                              １.２.４ 系统发育分析  通过叶绿体基因组数据和
            花属特有物种相关资料ꎬ加深对它们的认识ꎬ并为                             一代测序数据分别构建 ２ 个数据矩阵进行系统发

            后续保护研究奠定基础ꎮ                                        育分 析ꎬ 并 将 所 得 结 果 相 互 印 证ꎮ 从 Ｆｕ 等
                                                               (２０２２ｂ)所使用的 １３９ 个物种的基因组序列( 包括
            １  材料与方法                                           １９ 个大麻科、桑科、荨麻科等其他科的物种数据作
                                                               为外类群)中选取下载 ２５ 个物种的叶绿体基因组
            １.１ 材料                                             序列ꎬ以 Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ 和 Ｍｏｒｕｓ ｉｎｄｉｃａ 作为外类群ꎬ
                 以勐海冷水花为实验材料ꎬ材料采自中国科                           使用 Ｐｈｙｌｏｓｕｉｔｅ ｖ１. ２. ３ 软 件 ( Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０ꎻ
            学院西双版纳热带植物园于 ２０１９ 年从勐海曼稿                           Ｃｈｕａｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２３ ) 基 于 包 含 勐 海 冷 水 花
            保护区引种的植株(引种号:００ꎬ２０１９ꎬ０６９９)ꎬ叶片                      (ＧｅｎＢａｎｋ 登录号为 ＰＰ５０４９１１) 在内的 ２５ 个物种
            采摘 后 置 于 硅 胶 中 干 燥 保 存ꎬ 用 于 总 ＤＮＡ 的                的叶绿体基因组序列ꎬ通过最大似然法( ｍａｘｉｍｕｍ
            提取ꎮ                                                ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄꎬ ＭＬ) ( Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５) 和贝叶斯法
            １.２ 方法                                             (Ｂａｙｅｓｉａｎ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅꎬ ＢＩ)(Ｒｏｎｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１２) 构
            １.２.１ 形态观察和濒危状况评估  所有形态学特                          建系统发育树ꎮ 在该数据基础上新增厚叶冷水花
            征均通过日本奥林巴斯 ＳＺＸ１６ 双目体式显微镜                           ( Ｐ.  ｓｉｎｏｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ ) ( ＧｅｎＢａｎｋ  登 录 号 为
            (Ｏｌｙｍｐｕｓ ＳＺＸ１６ ｂｉｎｏｃｕｌａｒ ｓｔｅｒｅｏ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ) 在采     ＯＮ５５７６２６. １ )、 丹 霞 冷 水 花 ( Ｐ. ｄａｎｘｉａｅｎｓｉｓ )
            集样本上观察ꎮ 对于瘦果形态ꎬ进行扫描电子显                             (ＧｅｎＢａｎｋ 登录号为 ＯＮ５５７６２５.１) 和勐海冷水花
            微镜 ( ＺＥＩＳＳ ＥＶＯ１８ꎬｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅꎬ     的 ＩＴＳ、ｒｂｃＬ 与 ｔｒｎＬ￣Ｆ 基因片段数据ꎮ 将 ３ 个数据
            ＳＥＭ)观察ꎬ并至少使用 １０ 个瘦果来确定其大小                          矩阵分别进行比对后进行手动调整ꎮ 对 ２ 个叶绿
            和表面装饰ꎮ 瘦果材料从样本中收集ꎬ干燥后用                             体基因片段( ｔｒｎＬ￣Ｆ、ｒｂｃＬ) 联合数据矩阵与 ＩＴＳ 数
            双面胶粘贴于样品台上并使用溅射仪进行真空镀                              据矩阵通过 ＭＬ 生成的系统发育树进行比较ꎬ确认
            金ꎬ镀金后在扫描电子显微镜下观察和拍照ꎮ 依                             其拓扑结构是否存在冲突ꎮ 基于 ＩＴＳ 联合叶绿体
            据 ＩＵＣＮ 标 准 ( ＩＵＣＮ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎꎬ     基因片段(ｔｒｎＬ￣Ｆ、 ｒｂｃＬ)数据矩阵通过 ＭＬ 和 ＢＩ 进
            ２００１)对勐海冷水花进行了物种濒危现状评估ꎮ                            行系统 发 育 分 析ꎬ 以 得 到 支 持 率 更 高 的 系 统 发
            １.２.２ 总 ＤＮＡ 提取和测序  取已干燥的勐海冷水                       育树ꎮ
            花叶片ꎬ采用改良的 ＣＴＡＢ 法(陈林杨等ꎬ ２０１４)提
            取总 ＤＮＡꎬＤＮＡ 提取产物用紫外分光光度计进行                          ２  结果与分析
            检测ꎮ 取 ２ μＬ ＤＮＡ 样品ꎬ用 Ｎａｎｏｄｒｏｐ 分光光度计

            (ＮＤ￣１０００ꎬＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃꎬＵＳＡ)检测 ＤＮＡ       ２.１ 叶绿体基因组结构、功能与序列特征
            的浓度和纯度( Ａ２６０ / ２８０ 值)ꎮ 提取获得的 ＤＮＡ                       勐海冷水花叶绿体基因组全长 １５２ ０７９ ｂｐꎬＧＣ
            产物送上海美吉生物医药科技有限公司进行后续                              总含量为 ３６.６２％ꎬ呈环状四分体结构(图 １)ꎬ包括 １
            的文 库 构 建 和 基 因 组 浅 层 测 序ꎬ 测 序 读 长 为                个大单拷贝区 ( ｌａｒｇｅ ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｐｙ ｒｅｇｉｏｎꎬ ＬＳＣ)ꎬ 长
            ＰＥ１５０ꎬ最终获取约 ２ Ｇｂ 的数据量ꎮ                             ８３ １７８ ｂｐ( ＧＣ 含量为 ３４. ２２％)ꎬ１ 个小单拷贝区
            １.２. ３ 基 因 组 组 装 和 注 释        通 过 ＧｅｔＯｒｇａｎｅｌｌｅ     (ｓｍａｌｌ ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｐｙ ｒｅｇｉｏｎꎬ ＳＳＣ)ꎬ长 １８ ３５５ ｂｐ(ＧＣ 含
            (ｖ１.７.７.０)对得到的有效数据进行基因组的拼接                         量为 ３０. ４７％)ꎬ 以 及 ２ 个 反 向 重 复 区 ( ｉｎｖｅｒｔｅｄ
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