Page 39 - 《广西植物》2025年第7期
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７ 期                       王莲哲等: 小麦 Ｔａｅ￣ｍｉＲ１６７ 克隆及抗旱功能分析                                   １ ２ ３ １

            在小麦不同器官及逆境胁迫下的表达特征ꎬ通过                              前体 二 级 结 构ꎮ 使 用 在 线 软 件 ｐｓＲｏｂｏｔ( ｈｔｔｐ: / /
            在拟南芥中过表达 Ｔａｅ￣ｍｉＲ１６７ｃꎬ研究其在干旱胁                       ｏｍｉｃｓｌａｂ. ｇｅｎｅｔｉｃｓ. ａｃ. ｃｎ / ｐｓＲｏｂｏｔ/ ) 进 行 靶 基 因
            迫响应中的功能ꎮ 本研究拟探讨以下问题:( １)                           预测ꎮ
            Ｔａｅ￣ｍｉＲ１６７ 家族的序列及结构差异ꎻ(２)成熟 Ｔａｅ￣                   １.３ 干旱处理和表达分析
            ｍｉＲ１６７ 对小麦逆境胁迫的响应ꎻ(３) 过表达 Ｔａｅ￣                         小麦种子发芽后培养于 ２５ ℃ 、光照 / 黑暗(１６
            ｍｉＲＮＡ１６７ｃ 株系抗旱性功能ꎮ 本研究结果为 Ｔａｅ￣                     ｈ / ８ ｈ) 条件下ꎮ 分别用 ２０％ ＰＥＧ６０００ 溶液、２００
            ｍｉＲ１６７ 功能研究提供基础ꎬ并为小麦抗逆品种种                          ｍｍｏｌＬ ＮａＣｌ 溶液及 ４ ℃ 处理 １０ ｄ 大的幼苗来
                                                                       ￣１
            质创新提供基因资源ꎮ                                         模拟干旱胁迫、盐胁迫、低温胁迫处理ꎬ以未处理
                                                               的材料为对照(Ｈｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１３)ꎮ 在各种处理后 ６
            １  材料与方法                                           ｈ 提取叶片 ＲＮＡ 用于胁迫处理下基因表达分析ꎻ
                                                               小麦根、茎、叶、穗、种子不同器官分别取样ꎬ提取
            １.１ 植物材料                                           ＲＮＡ 用于器官表达量分析 [天根生化科技( 北京)
                 小麦(Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍꎬ‘中国春’ 品种)、野生             有限公司]ꎮ

            型拟南芥(哥伦比亚 Ｃｏｌ￣０ 株系)均为实验室保存ꎮ                            使用 ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ 第一链合成试剂盒( 诺唯
            １.２ 小麦 Ｔａｅ￣ｍｉＲ１６７ 鉴定及生物信息学分析                       赞公司) 反转录 ｃＤＮＡ 并做模 板ꎬ以 Ｔａｅ￣ｍｉＲ１６７
                 从 ｓＲＮＡａｎｎｏ ( ｈｔｔｐ: / / ｐｌａｎｔｓｒｎａｓ. ｏｒｇ / ) 和  的 ３ 种成熟区序列分别设计特异引物(表 １)ꎬ以小
            ＰｍｉＲＥＮ 数据库查询 Ｔａｅ￣ｍｉＲ１６７ 序列ꎬ并筛选合                    麦 Ａｃｔｉｎ 基 因 为 内 参 进 行 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 分 析ꎮ 使 用
            并ꎮ 使用 ＣｌｕｓｔａｌＷ 软 件 对 Ｔａｅ￣ｍｉＲ１６７ 成 熟 序 列            ２  －ΔΔＣｔ 方法计算基因相对表达量ꎮ 所有样品均进行
            进行比对ꎬ用在线工具 ＲＮＡｆｏｌｄ 分析 Ｔａｅ￣ｍｉＲ１６７                   ３ 个生物学重复分析ꎮ


                                                 表 １  ｑＲＴ￣ＰＣＲ 引物序列
                                            Ｔａｂｌｅ １  Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｑＲＴ￣ＰＣＲ
                  引物名称                        上游序列(５′－３′)                             下游序列(５′－３′)
                 Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ               Ｕｐｓｔｒｅａｍ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′－３′)              Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′－３′)
                 Ｔａｅ￣ｍｉＲ１６７ａ               ＧＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＴ                     ＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴ
                Ｔａｅ￣ｍｉＲ１６７ｂ                ＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＴＧ                     ＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴ
                 Ｔａｅ￣ｍｉＲ１６７ｃ                ＧＣＧＣＧＧＡＡＧＣＧＣＣＡＧＣ                      ＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴ
                  ＴａＡｃｔｉｎ                 ＴＧＣＴＡＴＣＣＴＴＣＧＴＴＴＧＧＡＣＣＴＴ                  ＡＧＣＧＧＴＴＧＴＴＧＴＧＡＧＧＧＡＧＴ



            １.４ 基因克隆、载体构建和遗传转化                                 ３００ ｍｍｏｌＬ 甘露醇的 １ / ２ ＭＳ 培养基模拟渗透
                                                                           ￣１
                 以提取小麦基因组 ＤＮＡ 为模板ꎬ设计特异性                        胁迫(Ｈｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１３)ꎮ 将不同转基因株系种子
            引物( Ｆ:５′￣ＧＧＣＡＧＴＧＴＣＡＣＧＡＧＧＴＧＴＧＡＧ￣３′ꎻ Ｒ:              培养于平板中ꎬ４ ℃ 春化 ４８ ｈ 后于 ２２ ℃ 温室中萌
            ５′￣ＣＴＧＧＧＡＧＡＴＴＴＴＧＴＡＴＧＧＡＧ￣３′) 并 进 行 ＰＣＲ              发ꎬ隔 １ ~ ３ ｄ 观察出芽情况ꎬ统计发芽率( 徐金鹏
            扩增ꎮ ＰＣＲ 程序如下:９４ ℃ 、３ ｍｉｎꎬ９４ ℃ 、３０ ｓꎬ５６             等ꎬ２０２０)ꎮ 待种子萌发后将种子铺在对应甘露醇
            ℃ 、３０ ｓꎻ７２ ℃ 、４５ ｓꎬ３０ 个循环ꎻ７２ ℃ 、１０ ｍｉｎꎮ 测          浓度平板中ꎬ２２ ℃ 垂直培养ꎬ生长约 １０ ｄ 后测定
            序 鉴 定 后 构 建 植 物 表 达 载 体 ｐＣＡＭＢＩＡ１３０４￣               根长ꎮ
            ｍｉＲ１６７ｃꎮ 重组载体转化农杆菌 ＧＶ３１０１ꎬ花序侵                      １.６ 胁迫处理及生理指标测定
            染法转化拟南芥ꎮ 含潮霉素的 １ / ２ ＭＳ 培养基筛                           拟南芥幼苗于 ２２ ℃、１６ ｈ / ８ ｈ 光照黑暗交替下

            选种子ꎬ生根后移入土壤中ꎬ提取各株系叶片 ＤＮＡ                           培养ꎬ控水 ３ 周后观察表型并测定生理指标ꎮ 参照
            进行 ＰＣＲ 扩 增 验 证ꎬ鉴 定 成 功 后 扩 繁 并 收 种 子               马艳丽等(２０１６)的方法测定含水量ꎻ参照努尔凯麦

            (贾会丽等ꎬ２０２０)ꎮ                                       尔木拉提等(２０２１) 的方法测定叶绿素 ａ 和叶绿
            １.５ 发芽率及根长分析                                       素 ｂ 的含量ꎻ采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量ꎮ
                 以正常的 １ / ２ ＭＳ 培养基为对照ꎬ用含有 １５０、                 每组重复 ３ 次ꎬＳＰＳＳ 软件进行统计分析ꎮ
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