Page 134 - 《广西植物》2026年第3期
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５ １ ０ 广 西 植 物 ４６ 卷
ＣＴＡＢ 法提取各组织总 ＤＮＡꎬ通过 １％琼脂糖凝胶 ＯＴＵ 聚类分析的基础上ꎬ利用 Ｍｏｔｈｕｒ( ｖ １.３０.２) 软
电泳检测总 ＤＮＡ 的提取质量ꎬ使用 ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ 件计算样品 α 多样性指数ꎬ其中 Ｃｏｖｅｒａｇｅ 指数衡
测定总 ＤＮＡ 浓度和纯度ꎮ 使用 ＩＴＳ１ (ＴＣＣＧＴＡＧ 量测序深度ꎬＣｈａｏ １ 指数和 ＡＣＥ 指数反映群落物
ＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ)和 ＩＴＳ２(ＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧ 种丰富度ꎬＳｉｍｐｓｏｎ 指数和 Ｓｈａｎｎｏｎ 指数反映微生
ＡＴＧＣ)引物对内生真菌的 ＩＴＳ１ 区进行 ＰＣＲ 扩增ꎮ 物多样性ꎮ 基于 ｂｒａｙ ｃｕｒｔｉｓ 算法使用 Ｑｉｉｍｅ 软件对
扩增前ꎬ在下游引物的 ５′上游添加 ｔａｇ 序列以区别 样 品 进 行 非 度 量 多 维 标 定 ( ｎｏｎ￣ｍｅｔｒｉｃ
不同样品ꎮ 采用 ２％琼脂糖凝胶电泳回收 ＰＣＲ 产 ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｃａｌｉｎｇꎬ ＮＭＤＳ ) 分 析ꎬ 并 采 用
物ꎬ利 用 ＡｘｙＰｒｅｐ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ( Ａｘｙｇｅｎ ＣＡＮＯＣＯ ４.５ 软件对广西莪术真菌群落与其主要
ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓꎬＵｎｉｏｎ ＣｉｔｙꎬＣＡꎬＵＳＡ)对回收 ＰＣＲ 产物 有效成分及土壤环境因子间的相互关系进行冗余
ＴＭ 分析(ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ ａｎａｌｙｓｉｓꎬＲＤＡ)ꎬ以期反映广西莪
进行 纯 化ꎬ 并 用 Ｑｕａｎｔｕｓ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ ( Ｐｒｏｍｅｇａꎬ
ＵＳＡ) 对 回 收 产 物 进 行 检 测 和 定 量 分 析ꎮ 使 用 术主要药材品质指标、土壤理化性质与广西莪术
ＮＥＸＴＦＬＥＸ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ￣Ｓｅｑ Ｋｉｔ 进 行 建 库ꎬ 利 用 根茎真菌群落的相互关系ꎮ
Ｉｌｌｕｍｉｎａ 公司的 ＭｉＳｅｑ ＰＥ３００ 平台进行测序ꎮ 采用 Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１６ 和 ＤＰＳ ７.０５ 系统对
将测序得到的数据进行质控和过滤ꎬ最终得 数据进行统计分析ꎮ 采用单因素方差分析中的
到有效数据ꎮ 应用 Ｕｐａｒｓｅ 软件(ｖ １１) 对所有样品 Ｄｕｎｃａｎ 新复极差法进行差异显著性检验ꎮ 所有结
的有效数据序列在 ９７％的相似度下进行种下操作 果均以平均值±标准差表示ꎮ
分类单元(ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｕｎｉｔꎬＯＴＵ)聚类ꎬ采
用 Ｑｉｉｍｅ 中 的 Ｂｌａｓｔ 方 法 与 Ｕｎｉｔｅ 真 菌 数 据 库 ２ 结果与分析
(Ｒｅｌｅａｓｅ ８. ０ ｈｔｔｐ: / / ｕｎｉｔｅ. ｕｔ. ｅｅ / ｉｎｄｅｘ. ｐｈｐ)进行
比对和注释ꎬ获得每个 ＯＴＵ 的分类学信息ꎮ ２.１ 广西莪术内生真菌高通量测序结果及多样性
１.２.２ 莪术药材品质指标的测量 参照 ２０２０ 年版 分析
«中华人民共和国药典» ( 国家药典委员会ꎬ２０２０) ２.１.１ 样本稀释曲线分析 以最后一次漂洗广西
的方法测量广西莪术根茎中的醇溶浸出物含量 莪术不同组织样品的无菌水涂布 ＰＤＡ 平板ꎬ７ ｄ 后
(ＡＳＥＣ)ꎬ其测量采用通则 ２２０１ 项下的热浸法测 观察平板表面未长出任何菌落ꎬ表明实验样品表
定ꎬ用稀乙醇作溶剂ꎮ 面消毒效果彻底ꎬ研究结果可信ꎮ 当大部分样品
１.２.３ 土壤理化因子测定 风干的土样倒入研钵中 的测序深度达到 ４０ ０００ 时ꎬ基于 ＯＴＵ 水平的 Ｓｏｂｓ
研细ꎬ分别过 ２ ｍｍ(测定 ｐＨ 用) 和 １００ 目(测定其 指数曲线趋于饱和ꎬ说明后续分析结果具有可靠
余 ７ 个 指 标) 筛ꎮ 采 用 常 规 分 析 方 法 ( 鲍 士 旦ꎬ 的生物学代表性ꎮ
２０００)测定根际土壤 ｐＨ、有机质(ＯＭ)、全氮( ｔｏｔａｌ ２.１.２ ＯＴＵ 聚类分析 基于≥９７％的相似性阈值ꎬ
ｎｉｔｒｏｇｅｎꎬ ＴＮ)、 全 磷 ( ｔｏｔａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓꎬ ＴＰ )、 全 钾 从 ４５ 份 广 西 莪 术 组 织 样 本 中 共 获 得 ２ ３５７ 个
(ｔｏｔａｌ ｐｏｔａｓｓｉｕｍꎬＴＫ)、有效磷(ａｖａｉｌａｂｌｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓꎬ ＯＴＵꎬ鉴定为 １３ 门 ４３ 纲 １１１ 目 ２６７ 科 ５４６ 属 ９０２
ＡＰ)、速效钾(ＡＫ)、水解性氮(ｈｙｄｒｏｌｙｚａｂｌｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎꎬ 种真菌(图 １:Ａ)ꎬ３ 个地区的 ＯＴＵ 分布呈现显著
ＨＮ)８ 个理化性质指标ꎮ 采用水浸提(水土体积比 地域差异:浦北县( ＰＢ) 以 １ ４１４ 个 ＯＴＵ 居首ꎬ其
为 ２.５ ∶ １) －电位法测定 ｐＨꎻ采用高温外热重铬酸 中特有 ＯＴＵ 达 ６４５ 个ꎻ 灵 山 县 ( ＬＳ) 和 钦 南 区
钾氧化容量法测定 ＯＭ 含量ꎻ采用凯氏定氮法测定 ( ＱＮ) 分 别 检 出 １ ２７３ 个 和 １ ０６３ 个 ＯＴＵꎬ 特 有
ＴＮ 含量ꎻ采用酸溶－钼锑抗比色法 ＴＰ 含量ꎻ采用氢 ＯＴＵ 数量分别为 ４７０ 个和 ３０７ 个ꎮ 共有 ＯＴＵ 分析
氟酸－高氯酸消煮－火焰分光光度法测定 ＴＫ 含量ꎻ 显示ꎬＰＢ 与 ＬＳ 共享 ＯＴＵ 最多ꎬＬＳ 与 ＱＮ 次之ꎬＰＢ
采用 ＦｅＳＯ ￣Ｚｎ 还原￣碱解扩散法测定 ＨＮ 含量ꎻ采 与 ＱＮ 最少ꎻ三者共有核心 ＯＴＵ 仅 ４５８ 个ꎬ比例较
４
用 ＮａＨＣＯ 法测定 ＡＰ 含量ꎻ采用乙酸铵浸提－火焰 低(１９.４％ꎬ４５８ / ２ ３５７)ꎬ说明广西莪术内生真菌群
３
分光光度法测定 ＡＫ 含量ꎮ 落具有较强的环境特异性ꎬ其组成可能受局部生
１.２.４ 数据统计分析 对各样品中的高通量测序 境因素(如气候、海拔或土壤)的显著影响ꎮ
数据进行均一化处理ꎬ使用 Ｒ 软件( ｖ ３.３.１) 绘制 广西莪术 ５ 个组织的 ＯＴＵ 数结果(图 １:Ｂ) 显
稀释曲线ꎬ检验测序数量的合理性ꎻ在数据序列 示: 叶组织(Ｙ)的 ＯＴＵ 总数(１ ２０５ 个)和特有 ＯＴＵ
